高表達MAL62基因對面包酵母耐高糖的影響

孫溪，劉海晴，張軍，范志華，黃亮

1(天津農學院 食品與生物工程學院，天津, 300384)2(天津市農副產品深加工技術工程中心，天津, 300384) 3(天津農學院 農學與資源環(huán)境學院，天津, 300384)

面包工業(yè)中常常使用含糖面團來制作甜面包，但高濃度的糖分會引發(fā)高滲脅迫，導致胞內水分外遷，擾亂并破壞細胞質膜上的離子梯度和細胞抵御能力，并最終使細胞破裂死亡[1]。為應對此種情況，酵母細胞通常會富集甘油、海藻糖、氨基酸等物質來抵御高滲脅迫引起的細胞損傷，提高菌株抗性[2]。

酵母菌能夠利用麥芽糖與MAL基因座(MAL1～4和MAL6)有關，每個MAL基因座均包含編碼麥芽糖運輸蛋白的MALx1(又名MALxT)，x代表基因座位置，編碼麥芽糖酶的MALx2(又名MALxS)，以及編碼正調節(jié)蛋白的MALx3(又名MALxR)，其中麥芽糖酶是麥芽糖水解的關鍵酶[3]。在之前的試驗中發(fā)現，工業(yè)酵母BY14a中高表達麥芽糖酶編碼基因MAL62，會提高突變株B+MAL62的胞內海藻糖含量，增強突變株耐冷凍能力[4]。海藻糖是一種非還原性的葡二聚糖，隨著外界生存壓力的增強，其在胞內的含量會隨之上升[5]。BELL等[6]發(fā)現，酵母在面臨滲透壓脅迫時，野生菌株比無法合成海藻糖的突變株(TPS1Δ、TPS2Δ)生存率更高。STAMBUK等[7]和JULES等[8]等研究發(fā)現，酵母從胞外向胞內轉運海藻糖時，菌株自身的麥芽糖代謝狀態(tài)會對這個過程有所影響，只有組成型表達的MAL基因座才能夠開啟Agt1p的海藻糖轉運功能。

目前有關菌體耐脅迫受麥芽糖代謝調控的相關研究僅集中在完整的MAL基因座上，針對單獨的麥芽糖酶與胞內海藻糖含量以及酵母耐高滲能力之間的聯系并無報道。由于海藻糖具有保護胞內可溶性酶和細胞膜穩(wěn)定性的功能[9]，因此，猜測MAL62基因的高表達可能會使突變株在耐冷凍以外獲得一定程度的耐高滲能力。鑒于此，本課題計劃探究麥芽糖酶編碼基因MAL62高表達對菌株的生長特性、形態(tài)特征、胞內應激物質積累及產氣在不同糖濃度環(huán)境下所帶來的影響，并與市售高糖酵母進行對比，初步探索相關現象出現的可能原因，為挖掘面包酵母麥芽糖酶多抗性奠定良好基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種及培養(yǎng)基

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)BY14a，天津科技大學張翠英教授惠贈；突變株B+MAL62及市售高糖活性干酵母GSJ與GML，保存于天津農學院發(fā)酵與釀造食品實驗室。

酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose,YEPD)培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸粉1%，固體YEPD添加瓊脂2%。LSMLD培養(yǎng)基：液體模擬面團培養(yǎng)基,其配方參考文獻[10]。高糖培養(yǎng)基：在LSMLD培養(yǎng)基基礎上，將葡萄糖質量分數替換為40%、50%與60%。培養(yǎng)基均需121 ℃滅菌20 min。

1.2 主要試劑與設備

葡萄糖、酵母浸粉和瓊脂粉，北京奧博星生物技術有限公司；蛋白胨，天津市英博生化試劑有限公司；海藻糖標準品(分析純99%)，Sigma公司；丙三醇(分析純)，天津試劑廠；甘油檢測試劑盒，Megazyme公司；高筋小麥粉，五得利金富強；其他未注明試劑均為分析純，國藥化學試劑公司。

恒溫培養(yǎng)箱(DHP-420BS)，天津市中環(huán)電爐有限公司；立式搖床(HNY-2102C)，天津歐諾儀器股份有限公司；移液器(Research plus)，Effendorf公司；高速冷凍離心機(gL20A)，中科院生物物理所技術服務公司；離子濺射儀(SD-3000)，北京博遠微納科技有限公司；臺式掃描電子顯微鏡(Phenom pro)，荷蘭飛納公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種培養(yǎng)條件

挑取1環(huán)菌泥接入5 mL YEPD培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min振蕩24 h，以1%接種量轉入高糖LSMLD培養(yǎng)基中，30 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)相應時間。

1.3.2 海藻糖與甘油檢測方法

取適量菌體，雙蒸水洗滌2次。胞內海藻糖測定采用硫酸蒽酮法[11]，甘油含量的測定采用Megazyme甘油檢測試劑盒[12]，實驗重復3次取平均值。

李離說：“昔年須菩提大師找孫悟空，弘忍大師找惠能，都是這么干的啊，米熟久矣，猶欠篩哉，提醒我們幾個，三更天等您回來啊！要是我們沒有認出您的花間游跟翡翠鐲子，聽吳耕的話，也騎驢子走了，您這半個月做掌柜的工夫豈不是白瞎了？”

1.3.3 生長性能測定

菌體在高糖培養(yǎng)基中30 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)64 h，每隔2 h取樣，雙蒸水洗滌2次后測定OD600，以空白培養(yǎng)基作為對照，繪制生長曲線，實驗重復3次取平均值。

1.3.4 細胞形態(tài)觀察

菌體在高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數期，雙蒸水洗滌菌體2次，立即涂布于導電膠，真空噴金，臺式掃描電鏡觀察。

1.3.5 產氣性能測定

杜氏產氣：每5 mL高糖培養(yǎng)基中接入1 mL種子液，30 ℃，間隔12 h觀察杜氏小管中產氣量。分為0～5等級：0級，管內無氣體；1級至5級分別為管內1/8、1/4、1/2、3/4及滿氣。結果取3次實驗平均值。

實際產氣實驗：采用量筒法進行實際產氣實驗[13]，含糖面團[14]于30 ℃條件下間隔30 min記錄體積，結果取3次實驗平均值。

1.3.6 數據統(tǒng)計方法

2 結果與分析

2.1 胞內物質含量

各菌株胞內海藻糖含量如圖1所示，40%糖脅迫環(huán)境下，B+MAL62胞內海藻糖含量為51.15 mg/g，比BY14a高出64.27%(P<0.05)；當糖質量分數由50%升至60%時，B+MAL62的胞內海藻糖則可分別比BY14a提高55.03%與59.06%(P<0.05)。但與市售高糖菌株相比，B+MAL62的優(yōu)勢則不明顯，當脅迫糖的質量分數由40%提至60%時，B+MAL62的胞內海藻糖僅僅比市售高糖酵母的平均值高出12.26%、12.44%和12.74%。因此，盡管高表達MAL62基因能夠明顯提升出發(fā)菌株的胞內海藻糖含量，但僅能夠達到與市售高糖酵母相近的水平。

圖1 高糖環(huán)境下各菌株的胞內海藻糖含量Fig.1 Contents of intracellular trehalose of the four strains under high sugar stress

各菌株胞內甘油含量如圖2所示，當脅迫糖的質量分數為40%時，B+MAL62的胞內甘油含量為17.41 μg/mg，為BY14a時的2.30倍；當糖的質量分數升至50%與60%時，則分別為2.20與2.24倍(P<0.01)。與市售高糖菌株相比，B+MAL62的胞內甘油水平亦具有優(yōu)勢。當糖的質量分數由40%升至60%時，B+MAL62的胞內甘油可以比市售高糖酵母的平均值高出27.10%、29.90%和28.45%(P<0.05)。因此，高表達MAL62基因能夠明顯提升出發(fā)菌株的胞內甘油含量，并使其高于市售高糖酵母的平均水平。

通過實驗發(fā)現，隨著糖濃度升高，各菌株胞內海藻糖及甘油的含量均呈現升高趨勢。其中B+MAL62菌株隨著滲透壓升高，胞內甘油提升速率較大，達到26.04%，其胞內海藻糖含量的提升速率也可達到11.11%。有報道稱，海藻糖合成基因TPS1、TPS2以及甘油合成關鍵基因GDP1的啟動子上均帶有STREs序列[15-16]，在許多脅迫基因的啟動子上，Msn2p、Msn4p與STREs綁定[17]，且Msn2p、Msn4p是Hog1實現高滲透壓脅迫下控制基因表達的重要轉錄激活因子[18]。因此，由實驗結果進行推測，MAL62基因的高表達可能通過影響Hog1、Msn2、Msn4通路，激活了TPS1、TPS2以及GDP1共同的STRE壓力響應元件；同時，MAL62基因高表達引發(fā)了麥芽糖酶水平提高[19]，很可能導致胞內葡萄糖等底物水平提高，致使海藻糖和甘油合成前體水平提高[20]，由此提升了菌株胞內海藻糖及甘油的含量。后期將進一步使用多組學方法分析并協通相關發(fā)酵實驗驗證上述內容，相關實驗正在進行中。

圖2 高糖環(huán)境下各菌株的胞內甘油含量Fig.2 Contents of intracellular glycerol of the four strains under high sugar stress

2.2 菌株生長性能的比較

由圖3可知，當脅迫糖的質量分數為40%時，B+MAL62菌株的停滯期為6 h，是BY14a的一半，與市售高糖菌株GSJ及GML的平均停滯期相近。當脅迫糖的質量分數為50%時，B+MAL62比對照BY14a停滯期減少50%，與市售高糖GML相近。總的來看，隨著糖濃度的增加，各菌株的延滯期也隨之增長，發(fā)酵至55 h后，所有菌株的OD600值均無明顯續(xù)增，甚至還會出現下降。這也許是因為高滲環(huán)境會造成細胞嚴重脫水進而使細胞失活[21]，或者由于在高糖脅迫下, 酵母細胞內會產生過量的活性氧和活性氮等有害物質, 促使線粒體產生超氧化物并激活一氧化氮合酶, 形成過氧亞硝基, 致使機體進一步被氧化而受損傷，甚至凋亡[22]。在高滲環(huán)境下，酵母會通過合成甘油與海藻糖平衡胞內滲透壓以防止細胞脫水[23-25]。實驗發(fā)現B+MAL62的胞內甘油與海藻糖快速增加，說明B+MAL62菌株可以獲得更多的胞內保護物質，這可以解釋為何B+MAL62菌株能夠在高糖環(huán)境下比對照菌更早進入對數期。

圖3 高糖環(huán)境下各菌株的生長曲線Fig.3 Growth curve of the four strains under high sugar stress

2.3 菌株細胞形態(tài)觀察

由圖4-a和圖4-d可知， 質量分數為40%糖脅迫時，市售高糖酵母GSJ與GML的細胞均出現不同程度的凹陷(箭頭處)，BY14a菌株(圖4-g)細胞表面出現部分褶皺，B+MAL62菌株(圖4-j)細胞呈橢球形，表面光滑，均勻，個體獨立。質量分數為50%糖脅迫時，GSJ和GML(圖4-b和4-e)的細胞表面已經出現大量凹陷甚至部分塌陷(箭頭處)，BY14a(圖4-h)也呈現出結構塌陷(箭頭處)，B+MAL62(圖4-k)失去平滑的外觀，出現凹凸不平(箭頭處)。

a-GSJ 40%;b-GSJ 50%;c-GSJ 60%;d-GML 40%;e-GML 50%; f-GML 60%;g-BY14a 40%;h-BY14a 50%;i-BY14a 60%; j-B+MAL62 40%;k-B+MAL62 50%;l-B+MAL62 60%圖4 高糖環(huán)境下各菌株的細胞形貌Fig.4 Cell morphology of the four strains under high sugar stress

隨著脅迫糖的質量分數升高至60%， GSJ和GML(圖4-c與4-f)的菌體嚴重坍塌，細胞壁破損，出現破碎組織；BY14a(圖4-i)的菌體也呈現塌陷與空洞(箭頭處)，B+MAL62(圖4-l)則皺縮嚴重，出現細胞黏連及部分塌陷(箭頭處)。據報道，高滲環(huán)境會影響面包酵母的糖酵解，糖異生、脂肪酸合成、細胞膜內的酶活性，這些代謝反應變化與面包酵母形態(tài)的改變有關[26]。此外，高滲環(huán)境下HOG途徑所涉及的壓力響應途徑與細胞壁完整性途徑存在協作關系，細胞壁損傷會同時激活上述2個途徑，使之一同調控酵母細胞壁有關葡聚糖形成的基因轉錄[27]。由于B+MAL62菌株胞內甘油含量提升，因此我們推測也許MAL62基因高表達會通過上述途徑增強細胞壁的穩(wěn)定性，進而減少高糖環(huán)境下B+MAL62菌株的破碎死亡率。

2.4 菌株產氣性能比較

由圖5可見， 質量分數為40%與50%糖脅迫時，GSJ與GML菌株直至發(fā)酵18 h時杜氏產氣等級仍大多處于2級(50%糖的GML菌株除外)；相比之下，B+MAL62菌株在糖質量分數為40%與50%時發(fā)酵12 h即可達到杜氏產氣3級，說明40%～50%糖環(huán)境下B+MAL62菌株的起始產氣能力大于GSJ、GML以及BY14a菌株。但是，當糖脅迫的質量分數升至60%時，B+MAL62菌株的快速產氣能力受到抑制，各階段產氣量與GSJ與GML菌株近似，失去了產氣速度的優(yōu)勢。

圖5 高糖環(huán)境下各菌株的杜氏小管產氣Fig.5 Gas production of the four strains in Durham’s fermentation tube under high sugar stress

為了進一步對比各菌株的實際產氣能力，采用量筒法檢測了4種酵母在實際含糖面團中的發(fā)酵力，結果如圖6所示。幾個時間點內，B+MAL62菌株的產氣量幾乎均為最大，在發(fā)酵末期可達到84 mL，分別高出GSJ、GML與BY14a 35.48%、6.33%和21.74%。從產氣速度來看，3 h內 B+MAL62菌株增長了66 mL，可分別高出其他菌株50.00%(GSJ)，4.76%(GML)與34.69%(BY14a)。

圖6 高糖環(huán)境下各菌株的實際面團產氣Fig.6 Gas production of the four strains in high sugar dough

有報道認為，酵母菌自身的甘油合成能力以及胞內海藻糖含量與菌株發(fā)酵力具有明顯的相關性[25, 28]，此外，實際面團發(fā)酵初期，菌體的抗壓反應機制會被迅速激活，HOG途徑相關的基因表達會劇烈變化[29]，由于HOG途徑與甘油等相關保護性物質關系密切，這意味著較高的胞內甘油含量可以更好地抵御實際面團發(fā)酵初期的各種脅迫，此外，胞內甘油還能夠明顯促進面團的持氣能力[24]。因此，具有較多胞內甘油和海藻糖的B+MAL62菌株可以更好地應對高糖面團發(fā)酵開始階段的低水活壓力，并最終在實際面團產氣方面體現出優(yōu)勢。

3 結論

基于前期研究基礎，本課題針對高表達麥芽糖酶基因MAL62的耐冷凍突變株B+MAL62進行了抗高糖方面的研究。發(fā)現質量分數為40%～60%的糖脅迫下，MAL62高表達能夠將酵母胞內海藻糖與甘油的含量分別提升23.42%～30.78%與0.88～0.96倍；并可以在高糖環(huán)境下更好地保持細胞形態(tài)的穩(wěn)定性。通過對B+MAL62菌株進行產氣測試發(fā)現，高糖環(huán)境下其產氣速度及最終產氣量均優(yōu)于出發(fā)菌株，甚至優(yōu)于市售高糖酵母。本研究為進一步探究酵母的多抗性提供了重要技術參考。