Rncat先天性白內(nèi)障小鼠模型培育及初步應(yīng)用

張 燕, 燕順生

(新疆維吾爾自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心,烏魯木齊830002)

新疆維吾爾自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心（原新疆維吾爾自治區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心）的研究人員于1993 年在昆明小鼠繁殖群中偶然發(fā)現(xiàn)眼部晶狀體混濁即具有白內(nèi)障癥狀的個(gè)體，經(jīng)過(guò)15 代的繁育，保留其白內(nèi)障癥狀的遺傳特性，建立了核心群，形成先天性白內(nèi)障（congenital catceraet）小鼠品系，培育成功先天性白內(nèi)障小鼠模型。隨后發(fā)現(xiàn)該白內(nèi)障小鼠模型為常染色體隱性遺傳，出生15 d 時(shí)在顯微鏡下可觀察到雙眼白內(nèi)障，20 d 時(shí)肉眼可見(jiàn)白內(nèi)障，35 d 時(shí)白內(nèi)障發(fā)育成熟。經(jīng)中國(guó)科學(xué)院上海生物工程研究中心鑒定及檢測(cè)，確定該品系小鼠先天性白內(nèi)障癥狀是由于Crygs基因突變引起的，后伴隨常染色體隱性遺傳，故命名該品系為Rncat 小鼠［1］。為進(jìn)一步推動(dòng)該突變小鼠的深入研究及應(yīng)用，現(xiàn)將Rncat 小鼠的生物學(xué)特性、行為學(xué)特性、突變基因鑒定及突變體蛋白的系列研究結(jié)果綜述如下。

1 Rncat先天性白內(nèi)障小鼠的生物學(xué)特性

1.1 繁殖性能測(cè)定

研究人員以Rncat 小鼠血緣擴(kuò)大群為研究目標(biāo)，選擇近交和封閉群養(yǎng)兩種不同的交配方式，研究分析Rncat 先天性白內(nèi)障種鼠的繁殖性能差異；通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析測(cè)定仔鼠繁育性能的各項(xiàng)指標(biāo)、仔鼠生長(zhǎng)情況，為今后該小鼠應(yīng)用于不同類型的臨床研究提供繁育、選育等方面的參考數(shù)據(jù)［2］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采取相同方式近交繁殖的Rncat先天性白內(nèi)障小鼠與BALB/c小鼠比較，繁殖性能各數(shù)值差異不大；但近交繁殖的Rncat 先天性白內(nèi)障小鼠與封閉群小鼠相比平均離乳數(shù)較少［（6.52±2.81）只vs（7.17±2.19）只］，差異顯著（P＜0.05），與昆明小鼠相比的平均離乳數(shù)［（10.54±3.42）只］更少，差異極顯著（P＜0.01）［2］。

1.2 體質(zhì)量測(cè)定

Rncat 先天性白內(nèi)障小鼠在全同胞兄妹交配的方式中，初生的仔鼠體質(zhì)量與BALB/c 小鼠相比明顯較輕［（1.73±0.11）gvs（1.54±0.23）g］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），這可能是由于Rncat 先天性白內(nèi)障小鼠來(lái)源于昆明小鼠，保留了昆明小鼠的生長(zhǎng)特點(diǎn)；但Rncat先天性白內(nèi)障初生小鼠與昆明初生小鼠的體質(zhì)量［（2.02±0.16）g］相比明顯較低，差異也極顯著（P＜0.01），這可能是由于近親交配方式降低其仔鼠的體質(zhì)量［2］。

1.3 晶狀體混濁度測(cè)定

近親交配的Rncat 白內(nèi)障小鼠保留了其先天性白內(nèi)障特質(zhì)。在近親交配繁殖的5代中，仔鼠出生時(shí)就被檢測(cè)出晶狀體核早期混濁癥狀，有極個(gè)別的小鼠出生時(shí)晶狀體混濁即達(dá)到中等程度；但改變其交配方式，在隨機(jī)交配4代以后，出現(xiàn)晶狀體核混濁延遲現(xiàn)象，甚至到了第五代，絕大部分仔鼠晶狀體核混濁延遲至20日齡左右出現(xiàn)。這說(shuō)明選擇不同的交配方式對(duì)Rncat 先天性白內(nèi)障小鼠的晶狀體核混濁癥狀有很大的影響。研究人員可以根據(jù)需要選擇Rncat 小鼠不同的交配方式，建立相應(yīng)的動(dòng)物模型，以滿足白內(nèi)障疾病各種不同臨床表現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)要求［2］。

1.4 其他生理生化指標(biāo)測(cè)定

研究人員還檢測(cè)了先天性白內(nèi)障小鼠的主要臟器質(zhì)量、血液學(xué)及血液生化等生物學(xué)指標(biāo)的數(shù)據(jù)［3］，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與28 日齡昆明小鼠相比較，同日齡白內(nèi)障小鼠的體質(zhì)量，以及心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腎上腺、胸腺、睪丸/卵巢的質(zhì)量和臟器系數(shù)的差異均不顯著；56日齡白內(nèi)障小鼠雌鼠的心臟質(zhì)量（168.00±23.35）mg、肝臟質(zhì)量（1 438.00±144.51）mg、肺臟質(zhì)量（186.00±19.50）mg、腎臟質(zhì)量（412.00±36.75）mg 以及雄鼠的心臟質(zhì) 量（197.00±25.23）mg、肝 臟 質(zhì) 量（1 426.00±114.46）mg、脾臟質(zhì)量（73.00±16.18）mg、肺臟質(zhì)量（200.00±27.22）mg 均低于昆明小鼠各項(xiàng)指標(biāo)，差異均顯著（P＜0.05），而且雌鼠體質(zhì)量（31.30±1.80）g、脾臟質(zhì)量（81.00±7.00）mg 以及雄鼠體質(zhì)量（34.60±1.90）g、腎臟質(zhì)量（598.00±31.06）mg、睪丸質(zhì)量（231.00±12.34）mg均低于昆明小鼠各項(xiàng)指標(biāo)，差異極顯著（P＜0.01）。

另外，雌鼠淋巴細(xì)胞比率（6.15±0.86）高于昆明小鼠，差異極顯著（P＜0.01）。56日齡白內(nèi)障小鼠與昆明小鼠的血液生化學(xué)檢測(cè)數(shù)據(jù)比較顯示，雌鼠堿性磷酸酶含量（203.75±31.93）U/L、葡萄糖含量（1.13±0.20）U/L 以及雄鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量（22.50±10.82）U/L、堿性磷酸酶含量（164.63±20.70）U/L、總蛋白水平（53.76±2.03）U/L等均低于昆明小鼠各項(xiàng)指標(biāo)，差異極顯著（P＜0.01）。56日齡白內(nèi)障小鼠與昆明小鼠的血液電解質(zhì)檢測(cè)數(shù)據(jù)顯示，所有指標(biāo)差異均不顯著（P＞0.05）。

2 Rncat 先天性白內(nèi)障小鼠行為學(xué)研究進(jìn)展

通過(guò)對(duì)先天性白內(nèi)障Rncat 小鼠的行為學(xué)表現(xiàn)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)比同月齡的Rncat 小鼠與正常的近交系BALB/c 小鼠及昆明小鼠在自主活動(dòng)度、協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)、體能和激惹度等方面的行為學(xué)數(shù)據(jù)，檢測(cè)到Rncat 小鼠在行為學(xué)上與其他近交系或封閉群小鼠存在明顯不同，這些數(shù)據(jù)的差異一方面可能與實(shí)驗(yàn)小鼠月齡相同但體質(zhì)量差異有關(guān)，另一方面也可能與白內(nèi)障小鼠病理改變導(dǎo)致的行為學(xué)改變有關(guān)［4］。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，在相同的環(huán)境條件下，Rncat 小鼠在中央格停留的時(shí)間和穿越格子的次數(shù)明顯多于其他小鼠（P＜0.05），客觀反映了Rncat 小鼠的自主活動(dòng)量高于其他小鼠，這可能是因?yàn)樵撔∈笙忍煨园變?nèi)障病理學(xué)改變引起了焦慮相關(guān)行為學(xué)變化。實(shí)驗(yàn)中所有小鼠在四周格的時(shí)間明顯多于其在中央格的時(shí)間（P＜0.05），這可能與小鼠對(duì)空曠環(huán)境的恐懼感及沿壁活動(dòng)的天性有關(guān)。另外，Rncat 小鼠與昆明小鼠在衣架實(shí)驗(yàn)及強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中行為學(xué)數(shù)據(jù)相近，但與BALB/c 小鼠差異顯著（P＜0.05），這可能是因?yàn)镽ncat 小鼠來(lái)源于昆明小鼠，相同月齡小鼠的腦對(duì)肢體的控制和體能等表現(xiàn)相似，而B(niǎo)ALB/c小鼠的近交繁殖特性導(dǎo)致其體型較小，體能較弱，與Rncat 小鼠及昆明小鼠相比差異顯著。懸尾實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Rncat小鼠與BALB/c小鼠及昆明小鼠相比，累計(jì)不動(dòng)時(shí)間較短，這為Rncat 小鼠可能成為絕望模型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物提供了一定的科學(xué)數(shù)據(jù)基礎(chǔ)［4］。

3 Rncat 先天性白內(nèi)障小鼠基因?qū)W研究進(jìn)展

國(guó)內(nèi)外科學(xué)家從1950 年代即開(kāi)始研究先天性遺傳性白內(nèi)障的相關(guān)基因位點(diǎn)，迄今為止在小鼠中至少有24 個(gè)遺傳性單純性白內(nèi)障基因被定位或被克隆。由于白內(nèi)障疾病的復(fù)雜性，目前的研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能闡明這一疾病的發(fā)生機(jī)制，根治該疾病還有很遠(yuǎn)的路要走，其中主要原因是人類先天性遺傳性白內(nèi)障的家族及樣本難以發(fā)現(xiàn)。目前，先天性白內(nèi)障已經(jīng)在有限的藥物和手術(shù)治療性策略中取得了一些進(jìn)展，但有效的治療性藥物及發(fā)病機(jī)制研究仍處于起步階段。

通過(guò)基因突變研究，發(fā)現(xiàn)Rncat 先天性白內(nèi)障小鼠的Crygs基因存在G489A突變，使得其翻譯產(chǎn)物γS 晶狀體蛋白在163 位由色氨酸（Vrp）變?yōu)榻K止密碼子，從而使本來(lái)由178個(gè)氨基酸組成的γS晶狀體蛋白變?yōu)橛?62個(gè)氨基酸組成的突變體，導(dǎo)致白內(nèi)障的發(fā)生［5］。最近研究發(fā)現(xiàn)，敲除Crygs基因的小鼠即無(wú)γS晶狀體蛋白表達(dá)，但并沒(méi)有引起明顯的晶體不透明性；通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)該基因敲除小鼠的眼晶體正常，但成熟的纖維細(xì)胞中細(xì)胞器不完整，存在肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的組織或代謝缺陷。這些研究結(jié)構(gòu)提示，Crygs基因敲除并不直接引起白內(nèi)障，先天性白內(nèi)障小鼠模型突變產(chǎn)生的162個(gè)氨基酸組成的突變體（蛋白）可能是先天性白內(nèi)障發(fā)生與發(fā)展相關(guān)分子機(jī)制的一個(gè)關(guān)鍵。

4 Rncat先天性白內(nèi)障小鼠突變體蛋白研究進(jìn)展

研究人員對(duì)先天性白內(nèi)障小鼠模型的162 個(gè)氨基酸組成的突變體（蛋白）進(jìn)行重組及克隆，獲得純化的162 個(gè)氨基酸組成的突變體（蛋白質(zhì)），并制備了抗體（一抗）、二抗和ELISA檢測(cè)試劑盒，隨后完成了不同發(fā)育階段的晶狀體蛋白質(zhì)組學(xué)定量研究［6］。用晶狀體蛋白定量ELISA檢測(cè)方法對(duì)不同發(fā)育階段的正常小鼠與先天性白內(nèi)障小鼠模型晶狀體內(nèi)2種蛋白進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)念珠（串珠）狀纖維結(jié)構(gòu)蛋白（BFSP1/Filensin）含量隨小鼠日齡的增長(zhǎng)逐漸下降，且在白內(nèi)障小鼠晶狀體內(nèi)的含量低于正常小鼠（P＜0.05）；βB2晶狀體蛋白含量隨日齡的增長(zhǎng)逐漸上升，且在白內(nèi)障小鼠晶狀體內(nèi)含量要高于正常小鼠（P＜0.05）。目前已初步完成了正常小鼠γS 晶狀體蛋白和162個(gè)氨基酸組成的突變體的免疫組織化學(xué)檢測(cè)工作。

先天性白內(nèi)障小鼠模型中白內(nèi)障的發(fā)生與發(fā)展常涉及內(nèi)源致病因素（如基因突變）產(chǎn)生的相關(guān)基礎(chǔ)蛋白及其相互作用形成的功能復(fù)合物，對(duì)這些重要蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行研究是揭示內(nèi)源性疾病發(fā)生與發(fā)展分子機(jī)制的關(guān)鍵，而且是相關(guān)診治策略制定和藥物研發(fā)的重要基礎(chǔ)［7］。對(duì)先天性白內(nèi)障小鼠模型的前期研究發(fā)現(xiàn)，由于基因突變，γS 晶狀體蛋白結(jié)構(gòu)可能發(fā)生改變，其晶狀體蛋白的功能也可能發(fā)生顯著變化。白內(nèi)障是一種多因素引發(fā)的眼科疾病，晶狀體蛋白是白內(nèi)障疾病發(fā)生的關(guān)鍵因素［8］。利用先天性遺傳性白內(nèi)障小鼠模型研究先天性白內(nèi)障小鼠Crygs基因突變導(dǎo)致突變體（蛋白）結(jié)構(gòu)和功能的變化，可進(jìn)一步了解晶狀體蛋白在白內(nèi)障發(fā)展過(guò)程中的變化機(jī)制及突變體的作用，進(jìn)而探討先天性白內(nèi)障疾病形成機(jī)制，為白內(nèi)障疾病發(fā)生機(jī)制的闡明和相關(guān)防治藥物的研發(fā)提供重要依據(jù)。

5 小結(jié)

新疆維吾爾自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心成功培育了Rncat 先天性白內(nèi)障小鼠模型，并進(jìn)行了繁殖性能、體質(zhì)量增長(zhǎng)、晶狀體混濁度等多項(xiàng)生理指標(biāo)及行為學(xué)測(cè)定，還對(duì)其作了基因?qū)W、突變體蛋白等研究，為從蛋白質(zhì)水平上闡明先天性白內(nèi)障及術(shù)后并發(fā)癥等晶狀體相關(guān)疾病的發(fā)生機(jī)制，以及預(yù)防和治療晶狀體相關(guān)疾病提供了直接的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，值得今后進(jìn)一步開(kāi)展應(yīng)用研究。