代謝組學在食品科學中的應用進展

李思源，李培瑜，劉弈彤，劉海杰，張澤俊，沙坤*

1(中國農(nóng)業(yè)大學 煙臺研究院，山東 煙臺，264670)2(中國農(nóng)業(yè)大學 食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京，100083)

代謝組學是繼蛋白質(zhì)組學、轉(zhuǎn)錄組學和基因組學之后的一種新興組學技術(shù)，是系統(tǒng)生物學的重要分支。它通過對生物體代謝產(chǎn)生的分子質(zhì)量低于1 kDa的代謝產(chǎn)物進行定性定量分析，研究生物體系的代謝途徑[1]。代謝組學通過分析生物體受到刺激或擾動后其代謝產(chǎn)物的變化或其隨時間的變化，動態(tài)地分析生物體的代謝過程[2]。根據(jù)研究對象的不同，代謝組學可分為靶向代謝組學和非靶向代謝組學，靶向代謝分析主要定量特定代謝物，研究一種或者幾種代謝通路，而非靶向代謝分析是盡可能地從樣本中分析出更多的代謝物，采集更多的物質(zhì)信息[3]。代謝組學技術(shù)的發(fā)展離不開核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)、質(zhì)譜(mass spectrograph，MS)、液相色譜(liquid chromatography, LC)、氣相色譜(gas chromatography, GC)及其聯(lián)用等技術(shù)的發(fā)展。NMR技術(shù)能夠在不破壞樣本的基礎上實現(xiàn)快速準確分析，但是不夠靈敏[4]；色譜與MS技術(shù)具有靈敏度高、分析速度快、應用范圍廣等特點，MS技術(shù)結(jié)構(gòu)鑒定能力強，但不具備分離能力，色譜與MS技術(shù)聯(lián)用可同時實現(xiàn)復雜混合物的分離、定性與定量分析[5]。一系列公開、方便、注釋良好的代謝組學數(shù)據(jù)庫，作為信息共享聯(lián)動的平臺，促進了代謝組學數(shù)據(jù)的分析[6]。這些數(shù)據(jù)庫包括：京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)、Mass Bank數(shù)據(jù)庫、METLIN數(shù)據(jù)庫、人類代謝組學數(shù)據(jù)庫(Human Metabolome Database，HMDB)等。

代謝組學研究起源于20世紀70年代，主要用于對患者體液中代謝物進行定性、定量分析及對疾病的篩選和診斷，90年代后，開始用于研究藥物在體內(nèi)的代謝等。代謝組學技術(shù)發(fā)展迅速，已成為臨床醫(yī)學和生命科學領域研究的重要工具，同時也為食品科學領域的研究提供了新思路。食品代謝組學將食品在生產(chǎn)、加工、儲存過程中的分子運動以及營養(yǎng)物質(zhì)被攝入后在食用者體內(nèi)的代謝過程和效果作為研究對象[7]，已用于食品成分分析、食品質(zhì)量鑒別、食品消費監(jiān)控、飲食營養(yǎng)監(jiān)控等[8]。本文從樣品制備與前處理、檢測技術(shù)、數(shù)據(jù)處理等方面介紹了代謝組學，并總結(jié)了代謝組學在食品營養(yǎng)、食品鑒別、食品風味研究領域的應用。

1 代謝組學研究中樣品制備與前處理方法

樣品制備作為代謝組學研究的第一步，是獲得可靠代謝組學數(shù)據(jù)的關(guān)鍵，要注意以下3個因素：第一，制備樣品的方法要盡可能簡單，可在不同實驗室由不同實驗人員重復操作；第二，步驟要盡量最少，有利于減少由于技術(shù)或分析的原因造成的可變性；第三，成本要盡量低，有利于擴大到更大的樣本數(shù)量[9]。在具體的實驗過程中，根據(jù)檢測技術(shù)的不同，所采用的樣品制備方法也有所不同。

在使用NMR技術(shù)檢測時，樣品無需復雜的前處理，若樣品為液體，如牛奶、醬油、酒等，加入含有氘代水的磷酸緩沖液提取后即可檢測；若樣品為固體或半固體，如奶油、肉、水果等，需要先將樣品攪碎，加入緩沖液提取后，再進行檢測[10-11]。

LC-MS聯(lián)用技術(shù)中樣品前處理通常是采用液液萃取和固相萃取。液液萃取具有選擇性，可與其他方法配合使用，操作簡單，周期短，常用的有機溶劑有甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、乙酸、乙酸乙酯等；固相萃取是通過選擇性吸附、洗脫來富集、分離和凈化樣品[12]。

GC-MS聯(lián)用方法常與頂空固相微萃取技術(shù)(headspace solid phase microextraction, HS-SPME)同時使用，這是一種集采樣、萃取、濃縮、進樣為一體的分析技術(shù)，操作簡單便捷、靈敏度高，可用于食品中揮發(fā)性成分、半揮發(fā)性成分、熱穩(wěn)定性成分的定性和定量檢測，具有良好的選擇性[13]。

2 代謝組學研究中的檢測技術(shù)

NMR、MS、GC是代謝組學研究中最常用的檢測技術(shù)，但是由于生命體的代謝過程復雜，代謝物種類繁多，單一的測定方法難以檢測完全，多采用幾種方法聯(lián)用。

2.1 NMR技術(shù)

NMR技術(shù)利用原子核在電場中的能級躍遷分析物質(zhì)的化學組成和空間機構(gòu)，可對小分子代謝物做出高通量分析，并且只需對樣品進行簡單的預處理，對樣品破壞性小，無偏向性，結(jié)構(gòu)信息豐富，適用于食品等復雜體系，是代謝組學研究過程中比較常見的方法[14]。NMR共振研究中，最常用的有核磁共振氫譜(1H-NMR)、核磁共振碳譜(13C-NMR)、核磁共振氮譜(15N-NMR)、核磁共振磷譜(31P-NMR)，其中1H-NMR在代謝組學中使用最為廣泛。1H-NMR代謝組學技術(shù)無偏向性，只要代謝成分含有質(zhì)子就能夠被檢測分析。李愛平等[15]基于1H-NMR代謝組學方法對山西陳醋、鎮(zhèn)江陳醋、白醋的化學組成進行檢測，由于食醋中含水量較大，使用了Noesypresat序列來壓制水峰，結(jié)果顯示，3種不同食醋的化學成分主要為有機酸和氨基酸，但組成明顯不同，其中氨基酸類物質(zhì)的檢測結(jié)果與氨基酸分析儀檢測結(jié)果一致，表明代謝組學結(jié)果可靠。SUZUKI等[16]利用1H-NMR代謝組學方法對食品添加劑絲蘭提取物的抑菌活性進行篩選，得到數(shù)據(jù)經(jīng)多元數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)皂苷含量與抑菌活性成正比。1H-NMR譜的信號強度只與待測溶液中的化合物摩爾濃度有關(guān)，可以直接比較樣品中化合物濃度。李瑋等[17]通過1H-NMR代謝組學技術(shù)鑒別天然奶油和人造奶油的差異脂類物質(zhì)，分析結(jié)果顯示，天然奶油黃油和稀奶油的甾醇、丁酸、1-戊烯、共軛亞油酸含量相比于人造奶油更高，與GC測定結(jié)果基本一致，說明通過這幾種物質(zhì)的含量差異，可以對天然奶油和人造奶油做出區(qū)分。

基于NMR的代謝組學技術(shù)適合檢測高豐度極性代謝物，可以使食品組分分析得更加細致。NMR技術(shù)通過對食品的有機酸、氨基酸、生物堿等有機化合物單體進行識別以及定性定量分析，在分子水平闡釋食物的特殊味道、香氣、質(zhì)地、色澤[15]，區(qū)分食物的產(chǎn)地、品種、質(zhì)量、加工方式和貯藏方式。但是NMR的靈敏度相對較低，不適合分析同一樣品中濃度相差較大的物質(zhì)，動態(tài)檢測范圍小，可通過提高磁場強度、應用同位素標記等來進行改進[18]。

2.2 LC-MS聯(lián)用技術(shù)

LC主要用于分離目標組分與基質(zhì)組分，適用于不易揮發(fā)、熱不穩(wěn)定、離子型和分子量較大物質(zhì)的分析，分離效率較高，縮短了分析時間；MS靈敏度高、特異性好、響應速度快。將LC與MS串聯(lián)使用，分離效能和分離速度可極大提高，分離度和檢測靈敏度得到明顯改善，還可同時測定多種代謝物[19]。BI等[20]通過電噴霧離子源將四級式飛行時間質(zhì)譜(quadrupole time-of-flight mass spectrometry)與高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)串聯(lián)，在河豚魚湯中鑒別出了與河豚湯的風味、營養(yǎng)和安全性密切相關(guān)的19種化合物。鄭海英等[21]基于HPLC-MS聯(lián)用的代謝組學方法研究了轉(zhuǎn)錄因子SINAC4對番茄果實代謝產(chǎn)物的影響，經(jīng)代謝組學分析，該轉(zhuǎn)錄因子對番茄代謝產(chǎn)物中的氨基酸、肽、維生素、糖類及其衍生物、核酸及其衍生物、生物堿、香精香料、有機酸均有影響。

2.3 GC-MS聯(lián)用技術(shù)

采用GC-MS聯(lián)用技術(shù)，可借助較完整的代謝物標準譜圖圖庫對代謝產(chǎn)物鑒定，目前較大的數(shù)據(jù)庫有Wiley庫、NIST庫和Palisade庫。GC通過分離作用，將目標物質(zhì)引入MS系統(tǒng)，MS部分起到檢測作用，主要有電離源、質(zhì)量分析器和電子倍增管，檢測后可得到保留時間、m/z，離子強度，通過這些信息可更準確的對物質(zhì)進行定性分析[22]。GC-MS聯(lián)用在食品風味研究中應用廣泛。馬小明[23]基于氣相色譜——飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析寧夏灘羊公羊和羯羊背最長肌的差異代謝物，有丙酮、辛烷、鄰苯二甲酸環(huán)丁基葵酯等14種，說明這些物質(zhì)是影響灘羊肉風味的主要物質(zhì)。GC-MS聯(lián)用技術(shù)對揮發(fā)性化合物靈敏性高、分離性好、重復性高。SUZUKI-IWASHIMA等[24]基于GC-MS聯(lián)用技術(shù)對干酪中的揮發(fā)性化合物進行代謝組學分析，確定了發(fā)酵過程中揮發(fā)性代謝物對奶酪特征香氣的影響。

3 代謝組學研究中的數(shù)據(jù)分析方法

代謝物的種類繁多，得到的譜圖復雜，因此，代謝組學研究中，數(shù)據(jù)分析是十分重要的環(huán)節(jié)。多元數(shù)據(jù)分析是目前使用較為廣泛的統(tǒng)計方法，通過對多個數(shù)據(jù)結(jié)果同時分析，發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)間的內(nèi)在關(guān)聯(lián)，實現(xiàn)對各個因素的綜合考慮，使研究結(jié)果更準確、偏差更小，利用多元數(shù)據(jù)圖還可實現(xiàn)分類的可視化表示[25]。多元數(shù)據(jù)分析方法可以研究各代謝物及代謝途徑，代謝物之間的差異可通過模式識別方法進行區(qū)分，主要的模式識別方法有主成分分析法(principal components analysis，PCA)，聚類分析法(cluster analysis, CA)，偏最小二乘判別分析法(partial least squares discriminant nalysis, PLS-DA)，正交偏最小二乘法判別分析法(orthogonal partial least squares discriminant analysis, OPLS-DA)[26]。

3.1 PCA

PCA技術(shù)是多元統(tǒng)計分析的一個基本方法，屬于無監(jiān)督的模式識別方法，能將實驗結(jié)果轉(zhuǎn)換成樣本與相應變量之間的關(guān)聯(lián)信息，將多個變量轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個主成分，通過這種方法得到實驗結(jié)果模型可分為得分圖(scores plot)和載荷圖(loadings plot)，得分圖顯示樣品信息，載荷圖表示變量信息，這個過程通過將相關(guān)信息分組成相同的主成分，降低了實驗數(shù)據(jù)的維數(shù)，簡化了數(shù)據(jù)集，達到以最少數(shù)據(jù)表示樣本的目的[27]。與其他多元統(tǒng)計分析方法相比，PCA操作簡單，沒有參數(shù)限制[28]。食品是一個復雜的體系，組分繁多，PCA通過降維把多個組分轉(zhuǎn)化為幾個綜合指標，根據(jù)各個指標數(shù)據(jù)的相關(guān)性和變異程度客觀地確定權(quán)重，挑選出影響食品性質(zhì)的主要特征成分，從而實現(xiàn)對食品品種、產(chǎn)地、加工方式等的鑒別。CHEN等[29]利用多元數(shù)據(jù)分析軟件SIMCA 14.1對3個薰衣草品種進行PCA，將3個品種的13個樣品的64種化合物處理得到13×64的數(shù)據(jù)矩陣，得分圖中，3個品種的主成分區(qū)并未重疊，說明這3種薰衣草的精油組成和相對百分含量是不同的；通過載荷圖分析得到了3個品種最主要的特征成分。SHUMILINA等[30]基于NMR代謝組學方法，區(qū)分新鮮和解凍過的大西洋鮭魚，經(jīng)PCA得分圖可知，在冷凍后第2～9天生成的天冬氨酸是造成樣本分組的主要因素之一，并通過驗證試驗證明在0 ℃以上，天冬氨酸途徑不會發(fā)生變化。這些結(jié)果表明，天冬氨酸可作為區(qū)分新鮮與和冷凍魚的標志性物質(zhì)。

3.2 CA

CA技術(shù)從多方面因素考慮對研究對象或指標進行分類，將樣品按照品質(zhì)特性的相似程度逐漸聚合在一起，相似度大的優(yōu)先聚合，最終根據(jù)類別綜合性質(zhì)多個品種聚合，完成聚類分析[31]。CA技術(shù)的優(yōu)勢在于可以發(fā)現(xiàn)多元數(shù)據(jù)中自然存在的分組或者類型，可用于食品品種分類、產(chǎn)地分類、加工方式分類等。BRIGANTE等[32]對含有奇亞籽、芝麻和亞麻籽的焙烤產(chǎn)品進行聚類分析，可以在樹狀圖上明顯地看出含有不同種子的產(chǎn)品被分為3個簇，每簇樣品對應的是一種種子，與主成分分析結(jié)果一致。林秀敏等[33]對不同產(chǎn)地和不同炮制方式的白芍飲片進行CA，通過樹狀圖可將其聚為幾類，說明生長環(huán)境及炮制方法可造成白芍飲片中的化學成分差異，這些結(jié)果可為不同白芍飲片的質(zhì)量控制提供參考。

3.3 PLS-DA

PLS-DA技術(shù)是一種線性分析方式，屬于有監(jiān)督分析方法，其本質(zhì)也是一種降維判別分析方法，可通過已知的樣品分組信息對多變量數(shù)據(jù)進行歸類、識別、預測，結(jié)合了PCA、典型相關(guān)分析和多元線性分析的優(yōu)點，適合于樣品觀測數(shù)少、解釋變量多及存在多重共線性的情況[34-35]。PLS-DA在食品質(zhì)量鑒別、食品品種識別、食品摻假辨別中應用較多。李永迪等[36]基于OPLS-DA分析得到影響茯磚茶和千兩茶品質(zhì)差異的標志性成分分別為:水浸出物、茶多酚、咖啡堿和簡單兒茶素，與PCA相比，這種方法不僅能鑒別樣品差異，而且可以獲得造成樣品差異的特征標記物。YOSHITOMI等[37]以NMR為基礎，研究了皂素根的天然代謝組學，將PCA和PLS-DA結(jié)合進行分析，結(jié)果表明甲醇萃取和5%甲醇洗脫有利于從野生樣品中鑒別栽培樣品，根據(jù)PLS-DA分析的s-plot圖，可知栽培樣品的特征化學物為蔗糖，野生樣品的特征物質(zhì)為葡萄糖和不飽和脂肪酸。許艷超等[38]通過PLS-DA對真假樣品進行分類來判斷蜂蜜摻假，結(jié)果表明建立的PLS-DA模型能夠很好的將真假蜂蜜分類，并且具有較好的預測能力。

4 代謝組學技術(shù)在食品科學領域的應用

4.1 在食品營養(yǎng)領域的應用

代謝組學在營養(yǎng)學領域的應用也稱作營養(yǎng)代謝組學，可研究食物中活性成分作用機制、食品營養(yǎng)素量對機體代謝的影響，代謝組學技術(shù)豐富了現(xiàn)代營養(yǎng)學研究方法，將食品科學與醫(yī)學有機結(jié)合起來[39- 40]。代謝組學可以通過監(jiān)測代謝物濃度來分析生理過程，適用于測量飲食的代謝效應[41]。JUNG等[42]研究了綠茶提取物對小鼠腸道微生物和皮膚的影響，通過全面的代謝組學分析，發(fā)現(xiàn)短期補充綠茶提取物可以顯著改善微生物代謝組和皮膚代謝組，特別是包括雙歧桿菌和乳酸菌在內(nèi)的益生菌水平和紫外線防御水平。王希越等[43]通過GC-MS的靶向代謝組學方法分析大米中脂肪酸，共檢測到16種脂肪酸，并以每種脂肪酸峰面積的相對偏差考察這種方法的穩(wěn)點性，16種脂肪酸相對偏差均小于10%，說明這種方法的穩(wěn)定性較好。將這種方法用于5種大米脂肪酸分析，可準確獲得個樣品間脂肪酸輪廓差異信息，可用于研究脂肪酸對大米營養(yǎng)價值及品質(zhì)改善的影響。XIA等[44]采用UPLC-Q-TOF-MS的代謝組學方法評估了馬奶發(fā)酵為馬奶酒的過程，確定了7個關(guān)鍵代謝途徑，共鑒定出354種代謝物，其中具有功能性的γ-亞麻酸、L-谷氨酰胺、初級膽汁酸在發(fā)酵過程中減少，γ-亞麻酸可以降血壓、降低心血管疾病和癌癥的發(fā)病率，L-谷氨酰胺可以用于治療胃腸道潰瘍、輔助癌癥治療、緩解疲勞、調(diào)節(jié)免疫，膽汁酸在脂肪代謝中起重要作用，能提高能量的利用，這一發(fā)現(xiàn)為馬奶及馬奶酒中功能性化合物的分離提供了重要信息。

4.2 在食品質(zhì)量鑒別中的應用

食品原料的來源是消費者進行選擇的重要依據(jù)，摻假問題也是消費者關(guān)注的重點，通過代謝組學技術(shù)通過對非特定目標物的檢測，可以更加精確的做出鑒別[45]。PAVLIDIS等[46]基于HS-SPME/GC-MS技術(shù)的代謝組學方法，對肉糜中及其添加劑的揮發(fā)組分進行了鑒別，篩選出了醛、醇、酮、呋喃、酯類等幾種具有鑒別意義的生物標志物，可用于區(qū)分肉的種類、鑒定未知品種肉類樣品。目前，消費者認為來自放牧奶牛群的高山奶酪更健康、營養(yǎng)價值更高，具有很高的市場價值，在這種情況下，奶農(nóng)和消費者都越來越多地要求保證以牧草為基礎的奶酪的真實性，SEGATO等[47]使用NMR代謝組學的方法對成熟時間不同的PDO奶酪的水溶性代謝物進行了分析，膽堿、2,3-丁二醇、賴氨酸、酪氨酸是根據(jù)奶牛飼養(yǎng)系統(tǒng)鑒別奶酪樣品最有效的水溶性化合物，但是，成熟過程的延長所引起的化學和生化變化復雜，所以用于成熟時間較短的產(chǎn)品，測得結(jié)果更準確。ZHANG等[48]基于GC-Q/TOF-MS 和 UPLC-Q/TOF-MS的代謝組學方法，篩選出46個初級代謝物和12個次級代謝物，可作為區(qū)分有機種植與非有機種植小麥的潛在生物標志物。

4.3 在食品風味研究中的應用

風味是影響食品品質(zhì)的重要因素之一，通過代謝組學方法，分析食品中代謝物與風味物質(zhì)的對應關(guān)系，可通過代謝水平研究風味物質(zhì)形成過程。ZHANG等[49]對無骨干腌火腿加工過程中的代謝物進行了研究，結(jié)果顯示，無骨干腌火腿加工過程中代謝物含量變化明顯，大部分代謝物含量呈上升趨勢，氨基酸(異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、谷氨酸和組氨酸)、有機酸(乳酸、醋酸、琥珀酸、檸檬酸和甲酸鹽)和核苷酸衍生物(次黃嘌呤)是無骨干腌火腿風味的主要來源。SUZUKI-IWASHIMA等[24]通過代謝組學方法研究了乳酸菌和霉菌對干酪中揮發(fā)型化合物生成的影響，結(jié)果顯示，干酪中受到乳酸菌影響的風味化合物主要是乳糖衍生化合物，由糖代謝產(chǎn)生，受到霉菌影響的風味化合物主要是氨基酸及其代謝物，由蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)生，脂肪酸、甲基酮、仲醇代謝途徑產(chǎn)生，主要在干酪后成熟期產(chǎn)生。這表明通過代謝組學方法監(jiān)測干酪成熟過程，再對乳酸菌及霉菌活性的進行精細調(diào)控，可開發(fā)出具有理想風味的干酪產(chǎn)品。

5 結(jié)語

代謝組學作為一種新興的組學技術(shù)，應用于食品科學領域一方面可為提升食品營養(yǎng)價值、風味品質(zhì)提供基礎數(shù)據(jù)，有效改善食品加工保藏技術(shù)；另一方面代謝組學技術(shù)也為食品的質(zhì)量檢測提供了新思路，能夠快速精確對食品進行鑒別，對食品安全和食品可追溯性有重要意義。但是，受到檢測技術(shù)、數(shù)據(jù)分析方法等的限制，代謝組學技術(shù)在食品科學領域的應用還遠未達到其最大潛能，具有廣闊的發(fā)展前景。因此，需要提高儀器的靈敏度和精確度，與不同的分析方法和平臺相結(jié)合，擴大代謝物的覆蓋范圍，提高數(shù)據(jù)質(zhì)量。另外，需要進一步開發(fā)功能全面的統(tǒng)計軟件來處理大量數(shù)據(jù)，從而更加有效的評估食品在加工生產(chǎn)過程的安全性和品質(zhì)特性等。