Shewanella marisflavi EP1高鹽度下呼吸2,4-二硝基甲苯的全基因組分析

黃杰勛，王漢林，黃衛(wèi)東，劉先利*

(湖北理工學院 a.環(huán)境科學與工程學院，b.礦區(qū)環(huán)境污染控制與修復湖北省重點實驗室，c.化學與化工學院，湖北 黃石 435003)

2,4-二硝基甲苯(2,4-DNT)作為硝基芳香化合物的典型代表物之一，被廣泛應用于制造推進劑、聚氨酯、炸藥、殺蟲劑、染料等化學品[1]。由于其具有較強的致癌性，在生產和使用過程中的不當處置會產生嚴重的土壤或水體污染問題[2]。

硝基具有較強的吸電子能力，這導致2,4-DNT難以通過好氧降解[3]。研究發(fā)現，二硝基甲苯的硝基可以先在厭氧環(huán)境下被微生物還原轉化為氨基，以消去硝基的吸電子能力，從而使得還原產物二氨基甲苯在好氧條件下較容易被降解[4-5]。此外，海洋沉積物被認為是人類活動產生的大量污染物的匯，包括2,4-DNT污染[6]。研究表明，海洋沉積物中的希瓦氏菌屬(Shewanellaspp.)在2,4-DNT污染的原位修復中起關鍵作用[7]。根據其16S rRNA基因序列，希瓦氏菌種可分為兩大類。第1類希瓦氏菌是從海洋環(huán)境中分離得到的，為專性海洋菌，與分離自淡水環(huán)境中的第2類希瓦氏菌相比，其更耐鹽分[8]。因此，研究專性海洋希瓦氏菌在較高鹽度下還原轉化2,4-DNT，有助于高鹽度污水中的硝基芳香化合物的修復。

S.marisflaviEP1菌株為專性海洋菌，分離自廈門近海沉積物[7]，具有厭氧還原轉化2,4-DNT的能力[8]。本文將在高鹽度條件下采用EP1對2,4-DNT的呼吸還原能力進行測定，并進一步對EP1的基因組進行測序和分析，以獲得其呼吸還原2,4-DNT和耐鹽性的相關遺傳基礎。

1 材料與方法

1.1 化學試劑

實驗用化學試劑有2,4-二硝基甲苯(2,4-DNT，純度≥ 99%，購自Sigma-Aldrich公司)、2,4-二氨基甲苯(2,4-DAT，純度≥ 98%，購自Aladdin公司)。用于高效液相色譜分析的試劑均為色譜純，購自美國Tedia公司；其他試劑均為分析純或更高純度，購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 培養(yǎng)基和生長條件

EP1菌株分離自海洋沉積物，存于中國典型菌物保藏中心(編號：CCTCC M 209016)。采用文獻[8]中的基礎培養(yǎng)基(BM)進行厭氧培養(yǎng)，用1 mol/L HCl或NaOH調整至pH=7.0，用高純氮氣(99.999%)吹掃10 min，以除去微量的溶解氧，封裝于50 mL血清瓶中，于121 ℃高溫滅菌20 min。實驗過程中乳酸鈉始終作為電子供體。在含有20 mmol/L乳酸鈉和40 mmol/L富馬酸鈉的厭氧培養(yǎng)基中，接種體預培養(yǎng)EP1 12 h后，取菌液8 000 ×g離心10 min，收集細胞，重懸于無菌BM中作為反應接種體。

1.3 高鹽度下呼吸還原2,4-DNT

實驗過程中使用嚴格的厭氧操作[9-10]。將EP1的預培養(yǎng)細胞接種到含有50 mL無氧BM的血清瓶中，分別加入10 mmol/L乳酸鈉和100 μmol/L 2,4-DNT作為電子供體和電子受體。細胞的初始濃度約為2.0×105CFU/mL。通過添加濃度為0～10%的NaCl來控制培養(yǎng)基的鹽度。所有反應體系均置于黑暗中30 ℃下靜態(tài)培養(yǎng)。為測定反應，使用無菌注射器從血清瓶中取出1 mL試樣，離心(10 000×g，2 min)后，取上清液分析。

1.4 全基因組測序

采用MO BIO公司的UltraCleanTM土壤DNA提取試劑盒提取并純化EP1基因組DNA。基因組測序工作由上海美吉生物醫(yī)藥公司完成，測序文庫采用SMRTbellTM模板制備試劑盒(Pacific Biosciences of California, USA)構建。使用PacBio RS II單分子實時(SMRT)測序平臺聯(lián)合Illumina測序平臺對EP1基因組進行測序，且Illumina數據用于評估基因組的復雜性。EP1基因組序列已上傳至NCBI的GenBank數據庫，登錄號為CP022272。

1.5 生物信息學分析

高通量測序讀長采用PacBio SMRT portal版本2.3.0中的Hierarchical Genome Assembly Process 3(HGAP3)進行組裝。用Quiver算法對裝配進行校正，以獲得高精度的基因組裝配[11]。

采用Circos (v0.64)處理已圖形化的環(huán)狀基因組圖譜[11]。一般基因組注釋使用NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline(PGAP)2.10版本[12]。快速功能注釋采用Rapid Annotation using Subsystem Technology(RAST)3.0版本以及Clusters of Orthologus Groups (COGs)[13]。

1.6 分析方法

使用配備C18色譜柱(Sun Fire，5 μm，φ4.6 mm×250 mm)的高效液相色譜(Waters e2695)測定2,4-DNT，流動相由水-甲醇組成。其程序如下：0 min時50%甲醇(V/V)，11 min時70%甲醇(V/V)，11～13 min時50%甲醇(V/V)。測定2,4-DAT，使用乙腈-磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L，pH=7.0，30/70，V/V)為洗脫液，流速1.0 mL/min。所有分析均在室溫下進行，進樣量為10 μL。使用菌落形成單位(CFU)測定細胞密度，將培養(yǎng)物在磷酸鹽緩沖液(pH=7)中稀釋，然后1式3份將100 μL等份試樣涂布在Luria-Bertani(LB)瓊脂平板上，于30 ℃培養(yǎng)24 h后，選取菌落個數為30～300的平板計數。

2 結果與討論

2.1 高鹽度下2,4-DNT的厭氧呼吸

不同鹽度下菌株EP1對2,4-DNT的還原轉化如圖1所示。圖1中，10 mmol/L乳酸鈉和100 μmol/L 2,4-DNT分別作為電子供體和電子受體，百分數表示NaCl濃度，誤差棒為3次平行的標準偏差。

圖1 不同鹽度下菌株EP1對2,4-DNT的還原轉化

由圖1可知，在非鹽條件下觀察不到2，4-DNT的轉化。這與EP1屬于專性海洋希瓦氏菌的事實相符，該類菌需要Na+才能生長[6]。轉化還原速率最大值出現在2%～4% NaCl濃度下，2,4-DNT在12 h內幾乎完全還原。在8%的鹽度下，菌株EP1在60 h內還原轉化約70%的2,4-DNT；在10%的鹽度下，菌株EP1在60 h內還原轉化約20%的2,4-DNT。

采用2,4-DNT上的硝基與細胞生長的相關性來考察EP1在8% NaCl高鹽度下呼吸還原2,4-DNT的情況。8%鹽度下硝基呼吸還原和細胞生長耦合情況如圖2所示。圖2中，硝基濃度由1 mol 2,4-DNT含2 mol 硝基計算。由圖2可知，伴隨硝基的還原，細胞密度增加了幾個數量級，最大達到4.1×107CFU/mL。在無2,4-DNT作為電子受體的空白對照中沒有觀察到細胞生長。此外，細胞生長與硝基還原同時發(fā)生，并隨著硝基耗盡而停止。

圖2 8%鹽度下硝基呼吸還原和細胞生長耦合情況

EP1菌株在含鹽環(huán)境中顯示出較強的DNT轉化能力，特別是與2種非專性海洋希瓦氏菌相比，S.putrefaciensCN32和S.oneidensisMR-1的最適生長僅發(fā)生在鹽度為0%時[5]。鹽度偏好表明，EP1為專性海洋菌，且更耐高鹽度。研究還發(fā)現，EP1可在高達20%的高NaCl濃度下對染料Xylidine Ponceau 2R還原脫色[13]。 為深入了解厭氧呼吸遺傳基礎并探索鹽分耐受性的潛在應用，對EP1全基因組序列進行測定，并開展生物信息學分析。

2.2 全基因組測序

目前，希瓦氏菌S.marisflavi種內還沒有獲得任何菌株的基因組序列。因此，對菌株S.marisflaviEP1的全基因組進行測序，以期獲得對遺傳性狀的更多了解。高通量測序共產生了52 966個高質量讀長，平均讀長7 518 bp。使用分層基因組組裝技術從頭開始重新組裝讀長，以生成僅含1個大重疊群(contig)的完整基因組。

S.marisflaviEP1基因組的一般特征見表1，S.marisflaviEP1的環(huán)狀基因組圖如圖3所示。圖3中，從外到內：環(huán)(1)顯示了以Mbps為單位的刻度線；環(huán)(2)和環(huán)(3)顯示了+和-鏈上的預測編碼基因，并通過不同的COG功能分類進行著色；環(huán)(4)代表tRNA(紅色)和rRNA(藍色)；環(huán)(5)和環(huán)(6)分別表示G+C含量和G+C偏移。由表1和圖3可知，EP1的基因組為4 321 452 bp的環(huán)狀染色體，G-C含量為50.0%。通過PGAP分析注釋，染色體上總共預測了3 661個蛋白質編碼基因，25個rRNA和98個tRNA(見表1)。此外，根據COGs數據庫的基因組功能注釋和分類，共有3 364個基因被劃分為22個不同的功能類別，包括能量產生和保存、氨基酸轉運和代謝、輔酶轉運和代謝、碳水化合物轉運和代謝、無機離子轉運和代謝、次級代謝產物合成、轉運和代謝等(見圖3(b))。

表1 S. marisflavi EP1基因組的一般特征

(a) S. marisflavi EP1的環(huán)狀基因組圖

(b) EP1基因組在COGs數據庫的功能注釋

2.3 與2,4-DNT呼吸和耐鹽性相關的基因

S.marisflaviEP1對2,4-DNT的還原轉換能力可能是細胞內多種電子傳遞系統(tǒng)蛋白共同作用的結果，尤其是c型細胞色素蛋白可能在2,4-DNT呼吸還原中起到重要作用[14]?；蚪M分析表明，EP1共有多達41種推定的c型細胞色素，包括10種10-血紅素細胞色素c和1種定位表面的非10-血紅素細胞色素c脂蛋白。與其他希瓦氏菌類似，EP1具有1個編碼c型細胞色素的基因座。這些色素構成Mtr電子的傳遞途徑[15]。希瓦氏菌中編碼胞外電子傳遞系統(tǒng)基因座對比如圖4所示。由圖4可知，EP1基因座中的基因排列與S.pealeana和S.halifaxensis最為相似。

圖4 希瓦氏菌中編碼胞外電子傳遞系統(tǒng)基因座對比

對于希瓦氏菌屬，Mtr呼吸途徑被認為是硝基化合物厭氧呼吸中必不可少的胞外電子轉移途徑[16-17]。4種血紅素c型細胞色素(包括MtrA，MtrB，MtrC和OmcA)是Mtr呼吸途徑的主要成分，均參與DNT呼吸還原。然而，敲除Mtr途徑并沒有導致DNT生物還原能力完全喪失。這表明除Mtr途徑之外的其他c型細胞色素可能也參與了DNT的還原[17]。這些結果與EP1的基因組分析結論一致，即除了Mtr途徑外，大約還有30種推定的c型細胞色素由EP1基因組編碼。c型細胞色素的多樣性表明希瓦氏菌中電子傳遞至DNT的機理比預期的更復雜。

S.marisflaviEP1基因組中耐鹽性相關基因見表2。由表2可知，EP1基因組包含多個鹽度耐受相關基因。編碼陽離子/H+反向轉運蛋白nha的基因使得細菌具有對高Na+濃度和高堿性的耐受性[18-19]。yggT基因編碼蛋白賦予細菌細胞對滲透休克的耐受性[19]。kef基因編碼的陽離子特異性通道蛋白參與滲透壓適應性[20-21]。trk基因也被發(fā)現存在于染色體上，其有助于Na+的胞外輸出，并提高細胞抗鹽能力[22]。

3 結論

EP1具有出色的2,4-DNT還原性能和耐鹽性，在含8%～10%NaCl的高鹽度下能有效地進行2,4-DNT的生物轉化。菌株EP1的基因組為環(huán)狀染色體，總長為4 321 452 bp，G-C含量為50%，包含3 661個編碼基因?；蚪M注釋發(fā)現包括Mtr呼吸途徑在內的共41種c型細胞色素負責電子轉移和硝基呼吸還原，多個耐鹽性相關的基因也在EP1基因組中被識別。高鹽度下EP1呼吸還原2,4-DNT的性能及其遺傳特征會加深對環(huán)境中硝基芳香族化合物轉化和歸趨的理解，同時還可為硝基芳香族化合物環(huán)境污染修復研究積累基礎。