譚媖子,劉彩霞,朱秋燕,鄧常清
近年來,心血管疾病發(fā)病率及死亡率逐年升高[1],且已成為威脅國民健康的頭號殺手[2]。血管內(nèi)皮細胞(vascular endothelial cells,VEC)損傷是多種心血管疾病的起始及關鍵環(huán)節(jié),正常狀態(tài)下VEC具有心血管系統(tǒng)屏障功能,且能合成并分泌多種生物活性物質(zhì),具有抗血栓、調(diào)節(jié)血管舒縮活動并抑制細胞遷移與趨化等功能[3],在調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮了重要的作用[4]。因此,保護VEC免受各種理化因素的損傷,修復與改善VEC功能對心血管疾病防治具有重要的臨床意義。有研究發(fā)現(xiàn),氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)是引起VEC形態(tài)和功能損傷的重要因子[5],ox-LDL具有強烈的細胞毒性,通過氧化應激直接損傷VEC形態(tài),增加內(nèi)皮細胞間隙,改變血管通透性;ox-LDL還通過抑制一氧化氮(NO)及其合成酶表達,增加活性氧產(chǎn)生,引起VEC功能障礙[6-7]。因此,改善氧化應激引起的VEC形態(tài)損傷及功能紊亂對治療心血管疾病具有重要意義。
黃芪和當歸配伍具有益氣補血活血的功效,有研究發(fā)現(xiàn),黃芪、當歸配伍不僅可促進造血,而且對心血管具有保護作用,如黃芪、當歸配伍可促進內(nèi)皮細胞增殖、抗氧化、抑制細胞凋亡等[8-9]。本課題組前期研究表明,黃芪和當歸配伍可抑制血管內(nèi)膜增生,改善局部血管炎性反應,減輕細胞外基質(zhì)在血管壁沉積,抑制血管平滑肌細胞表型轉化和增殖[10-11]。由于VEC損傷是血管內(nèi)膜增生的起始環(huán)節(jié),推測黃芪、當歸配伍對VEC氧化損傷可能具有保護作用。藥物成分“敲出/敲入”是借鑒“基因診斷治療”以“譜-效”及“量-效”關系為切入點,采用中藥目標成分“敲出/敲入”研究模式。該研究模式以中藥整體為出發(fā)點,始終關聯(lián)藥效,注重中藥多組分的整合作用,可快速、準確地辨識關鍵的藥效物質(zhì)[12]。因此,本研究采用VEC氧化損傷模型,觀察黃芪、當歸主要活性成分黃芪甲苷、黃芪皂苷-Ⅰ、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷、阿魏及芒柄花素配伍抗VEC氧化損傷的作用,運用藥物成分“敲出/敲入”中藥組分辨識模式,分析其主要藥效成分,明確主要活性成分對VEC氧化損傷的作用,為黃芪-當歸配伍用于VEC的保護治療提供實驗依據(jù)。
1.1 實驗細胞 實驗細胞株為人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),購自上海中僑新舟生物科技公司(批號:19195),鑒定含有因子Ⅷ相關抗原(ⅧR:Ag)表達陽性,符合VEC生物學特征。
1.2 實驗試劑 當歸主要活性成分:阿魏酸(ferulic acid,純度>99%,批號:A0050);黃芪主要活性成分:黃芪甲苷(astragaloside Ⅳ,純度>98.5%,批號:A0070)、黃芪皂苷-Ⅰ(astragalosideⅠ,純度>98.2%,批號:A0071)、芒柄花素(formononetin,純度>98.5%,批號:A0232)、毛蕊異黃酮(calycosin,純度>98.5%,批號:A0514)、毛蕊異黃酮苷(calycosin glycoside,純度>98.5%,批號:A0515)。上述各活性成分均購自成都曼思特生物有限公司。ox-LDL(廣州奕源生物有限公司,批號:YB002);DMEM培養(yǎng)液(Hyclone,批號:SH30022.01),胎牛血清(BI公司,批號:1923003),青霉素-鏈霉素溶液(碧云天生物技術公司,批號:SV30010),二甲基亞砜(DMSO,Sigama,批號:D2650-5X5ML),磷酸緩沖溶鹽液(PBS,hyclone,批號:SH30256.01),CCK-8試劑盒(日本同仁藥業(yè)株式會社,批號:CK04-500T),乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)試劑盒(碧云天生物技術公司,批號:C0016),胰酶消化液(Gibco,批號:25200056),碘化丙啶(PI,大連美侖生物科技公司,批號:MB2920),Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物科技公司,批號:KGA108),總NO試劑盒(碧云天生物技術公司,批號:S0023),一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)檢測試劑盒(碧云天生物技術技術公司,批號:A014)。
1.3 主要實驗儀器 CO2培養(yǎng)箱(CCL-17OB-8,新加坡ESCD),酶標儀(ELX-800,Bio-Tex),流式細胞分析儀(A00-1-1102,Beckman)。
1.4 實驗方法
1.4.1 主要活性成分試劑的制備 黃芪甲苷、黃芪皂苷-Ⅰ、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷、阿魏酸、芒柄花素以DMSO-DMEM溶解,制備成儲存液,使用時以無血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋,藥液中DMSO終體積分數(shù)≤0.1%。
1.4.2 內(nèi)皮細胞培養(yǎng)及分組 將HUVECs用含10%胎牛血清的DMEM制成細胞懸液,置于37 ℃無菌CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2~3 d換液1次,每周傳代2次,傳代第4代后用于實驗。
1.4.3 設計實驗方案 根據(jù)課題組前期研究[10-11],本研究以黃芪甲苷20 μg/mL、黃芪皂苷-Ⅰ 7.5 μg/mL、芒柄花素12.5 μg/mL、毛蕊異黃酮10 μg/mL、毛蕊異黃酮苷12.5 μg/mL、阿魏酸18 μg/mL為中點劑量,每個活性成分均設計6個劑量水平,藥物劑量以50%遞增或遞減。詳見表1。
表1 藥物活性成分劑量水平 單位:μg/mL
采用U6*(66)均勻設計,根據(jù)表1設定的6個劑量水平,得到6種活性成分6個不同的配伍實驗組,詳見表2。另外設正常組、模型組,共8組。將傳代的HUVECs細胞以適當密度接種于96孔板中,每組5個復孔,應用無血清培養(yǎng)基同步培養(yǎng)使細胞處于G0期。將細胞分組加入不同藥物成分培養(yǎng)2 h,再加入終濃度為200 μg/ mL ox-LDL培養(yǎng)24 h[13]。以CCK-8法采用酶標儀檢測波長450 nm吸光度(A)反映細胞活力,確定各活性成分的配伍濃度。細胞存活率=(藥物處理組A值-空白組A值)/(正常組A值-空白組A值)×100%。
表2 藥物活性成分均勻設計方案 單位:μg/mL
1.4.4 主要活性成分及其配伍抗VEC損傷實驗 在上述均勻設計實驗確定6種活性成分配伍基礎上,對6種活性成分及其配伍抗VEC損傷的作用進行研究。取指數(shù)生長期的HUVECs以適當密度接種于96孔板中,用無血清培養(yǎng)基將細胞同步于G0期。按表3方案分別加入不同藥物進行處理,處理完成后進行檢測。
表3 主要活性成分配伍實驗方案
1.4.5 觀察指標
1.4.5.1 LDH漏出率 細胞處理完成后,分別吸取培養(yǎng)液,以1 000 r/min離心10 min后取培養(yǎng)上清液,同時將離心管中的殘余細胞和培養(yǎng)板中的細胞加入等量培養(yǎng)液,分別置于-20 ℃、37 ℃反復凍融3次,再將凍融液以1 000 r/min離心10 min,取上清液作為細胞凍融液。采用比色法分別測定培養(yǎng)上清液和細胞凍融液LDH含量。按以下公式計算LDH漏出率:LDH漏出率(%)=培養(yǎng)上清液中LDH含量/(細胞凍融液中LDH含量+培養(yǎng)上清液中LDH含量)×100%。
1.4.5.2 培養(yǎng)液NO含量 細胞處理完成后,分別吸取培養(yǎng)液,以1 000 r/min離心10 min后取上清液。按比色法測定上清液NO含量,操作按說明書進行。
1.4.5.3 培養(yǎng)液NOS活性 細胞處理完成后,分別吸取培養(yǎng)液,以1 000 r/min離心10 min后取上清液。按比色法測定培養(yǎng)上清液總NOS活性,操作按說明書進行。
1.4.5.4 細胞周期測定 取對數(shù)生長期HUVECs,以每孔1×106個/mL鋪于6孔板,每組3個復孔,按上述處理后,取細胞以1 000 r/min離心5 min,去上清液,加入預冷的1 mL PBS洗滌2次,70%冰乙醇固定細胞過夜后,PBS重懸,離心去乙醇,收集細胞。加入10 μg/mL碘化丙啶工作液,4 ℃避光孵育30 min。應用流式細胞儀上機檢測,分析細胞周期各時象分布,并計算分裂增殖指數(shù)(proliferation index,PI),PI=[(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)]×100%。
1.4.5.5 細胞凋亡測定 HUVECs經(jīng)前述處理后,消化、離心、收集細胞。采用PBS重懸細胞并洗滌2次,將細胞數(shù)調(diào)整至5×105個/mL,每組3個復孔,加入Annexin V-FITC 10 μL和碘化丙啶工作液10 μL,輕輕混勻,4 ℃避光孵育30 min后每管加入 Binging Buffer 300 μL,1 h 內(nèi)應用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。
2.1 均勻設計實驗分析 與模型組比較,實驗組中1組~3組均能提高細胞活力,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。以細胞存活率進行多重線性回歸分析,建立多重線性回歸方程(設定回歸方程中X1代表黃芪甲苷、X2代表黃芪皂苷-Ⅰ、X3代表毛蕊異黃酮、X4代表毛蕊異黃酮苷、X5代表阿魏酸、X6代表芒柄花素,Y代表細胞存活率)結果如下:Y=0.586581+0.006854X2-0.003407X6-0.000228X1*X5+0.000 044X4*X6。該回歸方程經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計學意義(P=0.007 6),說明方程有意義,且擬合結果較好。由于要求細胞存活率(Y值)越高越好,故黃芪皂苷-Ⅰ、毛蕊異黃酮苷取實驗應用范圍最大值,黃芪甲苷、阿魏酸、毛蕊異黃酮、芒柄花素均取實驗應用范圍最小值,即黃芪皂苷-Ⅰ 30 μg/mL、毛蕊異黃酮苷50 μg/mL、黃芪甲苷2.5 μg/mL、阿魏酸2.25 μg/mL、毛蕊異黃酮1.25 μg/mL、芒柄花素1.562 5 μg/mL。
表4 均勻設計實驗細胞活力比較(n=5)
2.2 黃芪、當歸活性成分及其配伍對LDH漏出率的影響 與正常組比較,模型組LDH漏出率增加(P<0.01)。與模型組比較,各藥物單用組、藥物敲出組及6種成分配伍組LDH漏出率均降低(P<0.01)。黃芪甲苷單用組LDH漏出率低于黃芪甲苷敲出組(P<0.05),毛蕊異黃酮單用組LDH漏出率低于毛蕊異黃酮敲出組(P<0.05)。詳見圖1。
與正常組比較,☆☆P<0.01;與模型組比較,##P<0.01;與藥物單用組比較,*P<0.05。圖1 各藥物成分及其配伍對LDH漏出率的影響(n=5)
2.3 黃芪、當歸活性成分及其配伍對NO含量、NOS活力的影響 與正常組比較,模型組培養(yǎng)液NO含量和NOS活力均降低(P<0.01)。與模型組比較,各藥物成分敲出組及6種成分配伍組培養(yǎng)液中NO含量升高(P<0.01),黃芪皂苷-Ⅰ單用組及毛蕊異黃酮苷單用組培養(yǎng)液中NO含量升高(P<0.05);其他各藥物單用組、各藥物成分敲出組及6種成分配伍組培養(yǎng)液中NOS活力升高(P<0.01)。黃芪皂苷-Ⅰ敲出組培養(yǎng)液中NO含量高于黃芪皂苷-Ⅰ單用組(P<0.05),黃芪甲苷敲出組、毛蕊異黃酮敲出組、阿魏酸敲出組、芒柄花素敲出組培養(yǎng)液中NO含量和NOS活力高于相應的單用組(P<0.01)。與6種成分配伍組比較,黃芪甲苷單用組、黃芪皂苷-Ⅰ單用及敲出組、毛蕊異黃酮單用及敲出組、毛蕊異黃酮苷單用及敲出組、阿魏酸單用及敲出組、芒柄花素單用及敲出組NO含量降低(P<0.01);各藥物單用組及藥物敲出組NOS活力顯著降低(P<0.01)。詳見圖2、圖3。
與正常組比較,☆☆P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01;藥物敲出組與藥物單用組比較,*P<0.05,**P<0.01;單用藥物組、藥物敲出組與6種成分配伍組比較,△△P<0.01。圖2 各藥物成分及其配伍對NO含量的影響(n=5)
與正常組比較,☆☆P<0.01;與模型組比較,##P<0.01;藥物敲出組與藥物單用組比較,**P<0.01;單用藥物組、藥物敲出組與6種成分配伍組比較,△△P<0.01。圖3 各藥物成分及其配伍對NOS活性的影響(n=5)
2.4 黃芪、當歸活性成分及其配伍對細胞增殖的影響 與正常組比較,模型組細胞PI均降低(P<0.01),細胞增殖活力下降。與模型組比較,黃芪甲苷組、黃芪皂苷-Ⅰ組、毛蕊異黃酮敲出組、毛蕊異黃酮苷敲出組、阿魏酸組、芒柄花素單用組及6種成分配伍組PI增加(P<0.05或P<0.01),細胞增殖能力增強。黃芪甲苷敲出組、黃芪皂苷-Ⅰ敲出組、毛蕊異黃酮苷敲出組、阿魏酸敲出組、芒柄花素敲出組PI均強于相應的單用組(P<0.05或P<0.01)。與6種成分配伍組比較,黃芪皂苷-Ⅰ單用組、毛蕊異黃酮單用組、毛蕊異黃酮苷單用組、阿魏酸組、芒柄花素敲出組PI降低(P<0.05或P<0.01)。詳見圖4。
與正常組比較,☆☆P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01;藥物敲出組與藥物單用組比較,*P<0.05,**P<0.01;單用藥物組、藥物敲出組與6種成分配伍組比較,△P<0.05,△△P<0.01。圖4 各成分及其配伍對細胞增殖的影響(n=3)
2.5 黃芪、當歸活性成分及其配伍對細胞凋亡率的影響 與正常組比較,模型組正常細胞數(shù)減少,凋亡細胞增加,細胞凋亡率顯著增加(P<0.01)。與模型組比較,黃芪甲苷敲出組、黃芪皂苷-Ⅰ組、毛蕊異黃酮組、毛蕊異黃酮苷組、阿魏酸敲出組、芒柄花素組及6種成分配伍組凋亡細胞均減少,細胞凋亡率降低(P<0.01)。與各藥物單用組比較,黃芪甲苷敲出組、黃芪皂苷-Ⅰ敲出組、毛蕊異黃酮敲出組、阿魏酸敲出組、芒柄花素敲出組細胞凋亡率顯著降低(P<0.01)。與6種成分配伍組比較,黃芪甲苷單用組、黃芪皂苷-Ⅰ組、毛蕊異黃酮組、毛蕊異黃酮苷組、阿魏酸組及芒柄花素組細胞調(diào)亡率升高(P<0.01)。詳見圖5、圖6。
圖5 各組細胞凋亡流式檢測圖(Q1-LL為正常細胞;Q1-UR為早期凋亡細胞;Q1-LR為晚期凋亡細胞;Q1-UL為壞死細胞)
與正常組比較,☆☆P<0.01;與模型組比較,##P<0.01;藥物敲出組與藥物單用組比較,**P<0.01;單用藥物組、藥物敲出組與6種成分配伍組比較,△△P<0.01。 圖6 各藥物成分及其配伍對細胞凋亡率的影響(n=3)
ox-LDL是低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)氧化修飾而來,攜帶大量氧自由基。有研究發(fā)現(xiàn),高濃度ox-LDL在血管內(nèi)皮堆積,一方面誘導內(nèi)皮細胞產(chǎn)生大量活性氧,從而抑制NO及相關合成酶表達,引起炎癥反應及氧化應激反應,導致內(nèi)皮細胞功能障礙[6]。另一方面,ox-LDL通過上調(diào)血凝集素樣氧化型低密度脂蛋白受體-1(lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1,LOX-1)、Caspase等促凋亡分子和下調(diào)Bcl-2等抑制凋亡分子表達,促進細胞凋亡、抑制細胞增殖[14]。本研究結果發(fā)現(xiàn),ox-LDL干預細胞24 h后,可增加細胞LDH漏出率,抑制細胞增殖,促進細胞凋亡,降低細胞NOS活性,使NO合成減少。結果表明,ox-LDL通過誘導炎癥反應發(fā)生,增強氧化應激,損傷血管內(nèi)皮細胞形態(tài)和功能。
近年來,抗VEC氧化損傷成為心血管疾病防治的研究熱點,中藥以多靶點、多環(huán)節(jié)對抗VEC氧化損傷,改善VEC功能,符合防治心血管疾病的需求。黃芪當歸是心血管疾病臨床治療常用藥對,二者配伍應用最有名的是李東垣創(chuàng)立的黃芪、當歸配比5︰1的當歸補血湯。相關研究發(fā)現(xiàn),當歸補血湯具有促進血管新生、抗氧化等作用[14-16]。楊鵬等[17]研究發(fā)現(xiàn),當歸補血湯通過調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)與其受體(VEGFR)結合,促進缺氧VEC增殖。提示黃芪當歸配伍通過多靶點改善VEC氧化損傷,發(fā)揮保護心血管作用。
實驗研究表明,當歸補血湯含量最多的是來自黃芪的皂苷類成分(黃芪皂苷-Ⅰ、 黃芪甲苷-Ⅳ等)和黃芪酮類成分(毛蕊異黃酮、芒柄花素等)及來自當歸的有機酸(阿魏酸等)[18]。采用Caco-2細胞研究發(fā)現(xiàn),當歸主要成分阿魏酸,可提高黃芪中化學成分黃芪甲苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素在單層Caco-2細胞的滲透性,促進藥物成分吸收[19]。當歸揮發(fā)油中的主要化學成分蒿本內(nèi)酯是一種可抑制當歸補血湯生物效應的負性調(diào)節(jié)物質(zhì)[20]。中藥主要通過口服,腸道吸收,其藥效物質(zhì)是在體內(nèi)吸收的活性成分。唐蓉等[21]經(jīng)大鼠腸囊翻轉實驗發(fā)現(xiàn),黃芪和當歸配伍后,在小腸吸收的主要成分是阿魏酸、毛蕊異黃酮苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、黃芪甲苷5種活性成分。因此,本研究選擇黃芪甲苷、黃芪皂苷-Ⅰ、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷、芒柄花素及阿魏酸作為黃芪當歸配伍的主要藥效成分進行研究。
LDH是所有細胞組織均存在的活性成分,細胞損傷時,細胞內(nèi)LDH漏出到細胞外液中,導致細胞外液LDH含量增加,因此,LDH漏出率增加是細胞受損的表現(xiàn)。本研究結果發(fā)現(xiàn),黃芪、當歸6種主要活性成分及其配伍均可降低LDH漏出率,減少細胞損傷,且黃芪甲苷和毛蕊異黃酮敲出的LDH漏出率降低,提示6種成分均可抑制內(nèi)皮細胞損傷,其中以黃芪甲苷、毛蕊異黃酮作用較強。NO是VEC合成的血管舒張因子,NO合成和釋放障礙是內(nèi)皮功能受損的標志之一[22]。NO的合成與NOS活性有關,本研究結果發(fā)現(xiàn),ox-LDL可抑制內(nèi)皮細胞NOS活性,減少NO合成,誘導內(nèi)皮功能障礙[23]。黃芪、當歸6種主要活性成分及其配伍均能增強NOS活性,且黃芪皂苷-Ⅰ單用可增加NO含量,提示6種成分可增加NOS活性,且黃芪皂苷-Ⅰ可增加NO合成,6種成分對ox-LDL導致的內(nèi)皮細胞功能障礙具有保護作用,6種成分配伍作用顯著增強。細胞增殖實驗分析表明,黃芪甲苷和芒柄花素可促進細胞增殖,而黃芪皂苷-Ⅰ、阿魏酸可抑制細胞增殖,表明黃芪甲苷和芒柄花素可能是促進細胞增殖的有效物質(zhì),而黃芪皂苷-Ⅰ、阿魏酸對細胞增殖具有負向調(diào)控作用。細胞凋亡分析表明,黃芪皂苷-Ⅰ、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷、阿魏酸、芒柄花素均可不同程度地降低細胞凋亡率和細胞凋亡,6種活性成分配伍抗細胞凋亡的作用增強。提示這些活性成分是抑制細胞損傷的主要藥效物質(zhì),這些活性成分配伍可增強抗VEC氧化損傷作用,促進VEC功能和形態(tài)的修復。
綜上所述,黃芪、當歸活性成分及其配伍對ox-LDL誘導的HUVECs損傷具有保護作用,其機制可能與抑制細胞氧化損傷、抑制細胞凋亡、促進細胞增殖和修復有關。VEC氧化損傷機制復雜,黃芪和當歸的活性成分和作用形式多樣,本研究僅從體外細胞實驗進行了初步分析,對黃芪和當歸活性成分的作用特點和作用機制尚未明確,今后將從多角度研究黃芪、當歸活性成分配伍改善血管內(nèi)皮細胞損傷作用,進一步探索其作用機制,為VEC保護的藥效物質(zhì)提供科學依據(jù)。