影響龍須菜果孢子體形成內(nèi)外因素的初步研究*

楊金鑫, 張贏月, 楊 澤, 閆 昊, 徐 滌, 張學(xué)成

(中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院, 海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點實驗室， 山東 青島 266003)

近二十年來，產(chǎn)瓊膠江蘺科紅藻龍須菜(Gracilariopsislemaneiformis)的產(chǎn)業(yè)化栽培在中國發(fā)展很快，截止2018年已達(dá)年產(chǎn)量30萬t干品規(guī)模，取得了巨大的經(jīng)濟效益和凈化栽培海區(qū)水質(zhì)的生態(tài)效益[1-2]。此外，在夏季缺乏其他新鮮餌料的情況下，龍須菜還作為養(yǎng)殖鮑魚的輔助餌料得到很好的效果[3]，因此市場需求量逐年增加。

野生龍須菜分布于山東沿海潮間帶，一年中有兩次生長和繁殖季節(jié)，而在溫度太高的夏季和溫度太低的冬季基本不生長[4]。為了延長其生長期從而擴大產(chǎn)量，人們選擇了南移栽培方式，在福建首次獲得了龍須菜栽培的成功，栽培時間可以從秋季一直延續(xù)到來年的春季形成一個完整的養(yǎng)殖周期。隨著幾個龍須菜優(yōu)良新品種的研發(fā)[5-7]，其耐高溫的性狀得到提升，在北方海域也可以連續(xù)從晚春至秋季的生長，因此近幾年來逐漸形成了一個龍須菜南北輪栽的新栽培模式[1]。這不僅可以提高龍須菜的產(chǎn)量，還滿足了南北方相互間提供大量苗種的需求。

龍須菜栽培與其他江蘺科物種一樣，采用的都是人工夾苗的方式[8]。目前所有的龍須菜栽培品種都是二倍體的四分孢子體世代，依賴營養(yǎng)生長進行培養(yǎng)。這種栽培方法簡單易行，但也存在著一些明顯的不足：首先，需要大量的藻體作為苗種，藻枝的保存是主要困難。盡管目前南北輪栽模式較好地解決了這一問題，但長途運輸?shù)某杀竞惋L(fēng)險依然較高。第二，長期僅依靠營養(yǎng)生長會造成整個栽培海域藻種遺傳多樣性低，大規(guī)模病害發(fā)生幾率大，同時藻體本身還會發(fā)生種質(zhì)退化等問題[9]。中國另外幾個重要的海藻栽培物種，如海帶、紫菜等早已實現(xiàn)了培育生活史中某一階段的孢子來進行大規(guī)模生產(chǎn)，盡管育種過程會增加時間及成本，但從長遠(yuǎn)看不僅可以保證優(yōu)良苗種的保存和供給，同時也便于對種質(zhì)進行后續(xù)的改良，有利于栽培產(chǎn)業(yè)的長遠(yuǎn)發(fā)展。

鑒于以上原因，學(xué)者們早已開始探究利用孢子萌發(fā)實現(xiàn)江蘺物種的人工栽培方法，例如大量采集智利江蘺(Gracilariachilensis)釋放的四分孢子并附著在石片或網(wǎng)繩上進行萌發(fā)，證明了使用孢子對江蘺進行繁殖是可行的[10-11]；在夏威夷養(yǎng)殖的Gracilariaparvispora也進行了采集果孢子進行附著和擴大化栽培的成功試驗[12-13]；Zhou等的工作同樣表明可以通過采集四分孢子或果孢子對龍須菜實行規(guī)?；敝砙14-15]。

如果要實現(xiàn)江蘺的孢子采苗生產(chǎn)方式，則必須能在實驗室保存優(yōu)良品系的藻株并建立起一套促進孢子形成和釋放的方法和流程。但到目前，對孢子放散過程和存活率影響條件的研究較多[12,14,16-17]，而對孢子形成過程的影響因子研究較少。本實驗將使用在實驗室培育的由四分孢子萌發(fā)長成的龍須菜雌、雄配子體共培養(yǎng)進行受精，測試雌雄配子體藻枝部位、溫度、硝酸鹽濃度等因素對果孢子體形成過程的影響。

1 材料與方法

1.1 用于雜交實驗的龍須菜雌、雄配子體

本研究采用的一對龍須菜雌、雄配子體來自于在本實驗室采集和培育的由四分孢子發(fā)育的配子體。野生的成熟龍須菜四分孢子體采集自青島浮山灣，在實驗室內(nèi)進行了四分孢子的采集，待孢子萌發(fā)后逐一進行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：使用改良的f/2培養(yǎng)基進行培養(yǎng)[18]，光照50 μmol·m-2·s-1，溫度20 ℃，光周期L∶D= 12 h∶12 h。成熟的配子體通過兩兩雜交確定性別，最后確定使用一對雌、雄配子體進行擴培和實驗以確保數(shù)據(jù)不會因為個體遺傳差異而產(chǎn)生偏差。

如無特別說明，實驗所用雌雄配子體藻段都是保留有尖部生長點且長度大約為5 cm的一級分枝藻段。

1.2 龍須菜雌雄配子體的受精

將上述龍須菜雄配子體和雌配子體藻段放在一個三角瓶中進行受精。如無特殊說明基本培養(yǎng)條件同2.1，實驗期間不更換培養(yǎng)基。約10 d后可以在雌配子體表面觀察到果孢子體的形成，所有實驗組在第20天進行計數(shù)。

1.3 雄配子體藻枝部位對果孢子體形成的影響

將一條長約6 cm的帶有尖部生長點的雄性配子體藻段切開，分為上部和下部2個組，每段均在3 cm左右，然后分別與雌配子體進行雜交。每一個培養(yǎng)瓶中放入2條雄配子體藻段和3條雌配子體藻段，2組各設(shè)置3個重復(fù)。

1.4 雌配子體藻枝部位對果孢子體形成的影響

事先將雌配子體通氣培養(yǎng)，以促進分枝萌發(fā)，以確保每條雌配子體上至少有2個二級分枝[19]，此時的雌配子體藻段都大于10 cm。每一個培養(yǎng)瓶中放入1條雄配子體和1條上述雌配子體，設(shè)置3個重復(fù)。實驗結(jié)束后觀察果孢子體形成的位置。

1.5 溫度對果孢子體形成的影響

實驗分別設(shè)置10、15、20、25和30 ℃，5個不同溫度條件對龍須菜雌雄配子體進行雜交。每個培養(yǎng)瓶中放入1條雄配子體藻段和3條雌配子體藻段，每組各設(shè)置3個重復(fù)。

1.6 硝酸鹽濃度對果孢子體形成的影響

實驗分別設(shè)置0.5、1、5和10 mmol/L，4個硝酸鹽濃度對龍須菜雌雄配子體進行雜交。進行該項實驗時f/2培養(yǎng)基中原有的硝酸鹽未加入，但海水中的硝酸鹽(約為0.2 mg/L)未計算在內(nèi)[20]。每個培養(yǎng)瓶中放入1條雄配子體藻段和3條雌配子體藻段，每組各設(shè)置3個重復(fù)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

各實驗組在雜交的第20天記錄雌配子體上果孢子體的總數(shù)，然后計算平均每厘米雌配子體上的果孢子體數(shù)量。

數(shù)據(jù)采用ANOVA分析及t-檢驗來確定各實驗組果孢子體數(shù)的差異，P<0.05為差異顯著，P<0.01為極顯著。各圖數(shù)據(jù)上都標(biāo)明標(biāo)準(zhǔn)誤差(SD)誤差線。

2 結(jié)果

2.1 雄配子體藻枝部位對果孢子體形成的影響

圖1為兩種不同的雄配子體藻枝部位受精所形成的果孢子體數(shù)量的比較。統(tǒng)計分析表明P>0.05，說明兩個實驗組之間產(chǎn)生的果孢子體的數(shù)量無顯著差異。

圖1 雄配子體的不同部位受精形成的果孢子體數(shù)量比較

2.2 雌配子體藻枝部位對果孢子體形成的影響

圖2為雌配子體不同等級分枝上形成果孢子體數(shù)量的比較，從圖中可以看出，雌配子體一級分枝上形成的果孢子體數(shù)量顯著高于二級分枝上的果孢子體(P<0.01)。

圖2 雌配子體不同等級分枝上形成果孢子體數(shù)量的比較

根據(jù)多次實驗的結(jié)果，龍須菜的果孢子體主要形成于一級分枝上。如圖3所示，一級分枝上的果孢子體比在二級分枝上的分布密集，在本實驗中每厘米藻枝上的果孢子體數(shù)量約為二級分枝上的5倍。而且在一級分枝上，果孢子體可以在接近最頂端的區(qū)域形成，而二次分枝的尖端區(qū)域沒有果孢子體生長。據(jù)觀察，一般小于1.5 cm的二級分枝上不會形成果孢子體，而較長的二級分枝距尖端約1.5 cm內(nèi)也同樣沒有果孢子體形成。

圖3 雌配子體不同分枝上的果孢子體分布

2.3 溫度對果孢子體形成的影響

如圖4所示，溫度對果孢子體形成的影響極顯著(P<0.001)。在10～30 ℃所設(shè)置的5個組中，僅在20和25 ℃的條件下雌配子體上形成了果孢子體，而在較低或較高的溫度下都沒有形成。結(jié)果顯示20 ℃是受精的最佳溫度，形成果孢子體的數(shù)量最高，是25 ℃組的2倍以上。

圖4 溫度對果孢子體形成的影響

2.4 硝酸鹽濃度對果孢子體形成的影響

圖濃度對果孢子體形成的影響

3 討論

對江蘺果孢子采苗的研究往往針對其釋放及附著等后期的條件優(yōu)化，例如有報道溫度和光照會直接影響Gracilariacornea果孢子的釋放，但改變滲透壓和脫水處理的影響并不明顯[21-22]。Zhou等[14]分別對龍須菜果孢子的釋放和萌發(fā)過程進行了影響因素的分析，發(fā)現(xiàn)每個果孢子體在8～10 d內(nèi)可以逐步釋放0～5 653個果孢子；同時，在進行實驗的影響因素中只有溫度對果孢子的釋放具有極顯著的影響(P<0.01)，此外光強和鹽度也有影響(P<0.05)。但是這些報道都是采集野生的成熟藻體進行的相關(guān)實驗，而如果要實現(xiàn)全人工采苗的龍須菜栽培技術(shù)就必須嘗試建立全程可控的雌雄配子體雜交受精體系，以獲得在數(shù)量上可滿足大規(guī)模栽培產(chǎn)業(yè)所需的且同步成熟的果孢子。對于這個方面的研究很少，Zhou等[14]曾對溫度、鹽度、光照等幾個因素進行了測試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有溫度對龍須菜受精過程有顯著影響(P<0.05)。在本實驗中，我們通過對龍須菜的雌雄配子體進行受精來進一步研究能夠影響該過程的內(nèi)外因素。由于紅藻的卵細(xì)胞，即果胞不釋放到環(huán)境中，受精過程是精子的細(xì)胞核通過果胞頂端的受精絲進入后與果胞的細(xì)胞核進行的。這個過程對龍須菜無法量化觀察，因此我們用單位長度藻體上形成的合子數(shù)量，即寄生在雌配子體上的果孢子體數(shù)量來記錄實驗結(jié)果。

實驗結(jié)果顯示，龍須菜雌配子體藻枝的不同部位會對受精過程產(chǎn)生影響。首先，不同等級分枝的雌配子體表現(xiàn)出不同的生殖力。Ye等[19]曾在野生龍須菜四分孢子體的研究中發(fā)現(xiàn)80%的四分孢子囊分布于一級分枝上。與此類似，本實驗結(jié)果也表明一級分枝上的果孢子體比在二級分枝上分布的密集得多。其次，龍須菜為頂端生長，一般認(rèn)為藻枝的尖端為新生部位，新生的營養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成熟的生殖細(xì)胞應(yīng)該需要一定的時間，因此成熟度可能不如中下部的藻枝。但實驗結(jié)果卻顯示，無論是雄配子體還是雌配子體，成熟藻體一級分枝頂端部分的成熟度都并不是想象中那樣低，即整個藻體進入成熟階段后，其一級分枝頂端的新生細(xì)胞轉(zhuǎn)化為生殖細(xì)胞的速度很快，這與藻體萌發(fā)后需要很長時間才能從未成熟狀態(tài)進入成熟狀態(tài)不同。實驗表明，雄配子體上、下不同部位藻枝進行受精的兩個實驗組在形成果孢子體的數(shù)量上沒有明顯差別，一方面可能因為精子的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過果胞數(shù)量，盡管最尖端的少部分藻枝沒有成熟，但上部藻枝余下的成熟部分已經(jīng)能夠提供足夠的成熟精子用于受精；而另一方面也說明未成熟的頂端細(xì)胞比例應(yīng)該很小。這點從圖3中的雌配子體中同樣可以看出，對于一級分枝的雌配子體來說，最尖端的未成熟部分應(yīng)該僅在1～2 mm內(nèi)，其它部位都能形成果孢子體，也就是說這些部位有成熟的果胞形成。第三，雌配子體不同等級分枝的發(fā)育模式不同。如圖3所示，一級分枝上的果孢子體可以在接近最頂端的區(qū)域形成，說明雌配子體頂端新生的藻細(xì)胞快速發(fā)育成熟形成果胞；而與此同時，二級分枝距尖部約1.5 cm的區(qū)域內(nèi)卻沒有果孢子體形成，說明二級分枝頂端新生的藻細(xì)胞的成熟速度較慢。Wang等[17]對比了龍須菜四分孢子體一、二、三級分枝間的生長指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)盡管一級分枝的光合活性最高，但從生物量的增長速率來看反而不如二、三級分枝。綜合這些結(jié)果可以推測，一級分枝可能積累更多的能量用于生殖過程。

本文結(jié)果與Zhou等[14]都證實溫度是影響龍須菜受精過程的最重要的環(huán)境因素之一，而最適溫度的差異應(yīng)該與實驗材料的選擇及其起始培養(yǎng)溫度有關(guān)，我們選用的是實驗室長期培養(yǎng)的藻株而Zhou等[14]采用的是野生龍須菜。結(jié)果都顯示太高或太低溫度不利于龍須菜的受精過程，尤其是暫時的高溫(30 ℃)下盡管可以存活，但無法完成受精。本實驗顯示受精結(jié)果在硝酸鹽在不同實驗組間無明顯差異。

總之，要在龍須菜大規(guī)模生產(chǎn)上實現(xiàn)孢子采苗方式還有很多問題亟待解決，都需要有穩(wěn)定的優(yōu)良品種來源、簡便實用的采苗育種方式以及同步化生產(chǎn)技術(shù)。使用四分孢子或果孢子采苗各有利弊：四分孢子采苗的種源是四分孢子體，遺傳性質(zhì)比較穩(wěn)定，但釋放孢子數(shù)量不如果孢子，萌發(fā)的雌、雄配子體不僅生長狀態(tài)有差別，還會將能量多用于有性生殖從而影響營養(yǎng)生長和收獲；而每個果孢子體可釋放大量遺傳背景相同的果孢子，萌發(fā)形成的四分孢子體生長狀態(tài)相似，但前期需要雌雄配子體進行受精來獲得。這里我們對受精過程的影響因素開展了初步的工作，為龍須菜人工采苗技術(shù)的推進提供思路和數(shù)據(jù)。