響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取小米多酚*

張春穎 李 楠*

（運(yùn)城學(xué)院生命科學(xué)系，山西運(yùn)城 044000）

小米（Setaria itatica），又稱粟，是禾本科狗尾草屬植物粟或谷子的種仁，是我國北方地區(qū)主要雜糧作物之一，居五谷之首。近年來多酚已經(jīng)成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)之一，有研究表明，小米中酚類化合物含量較高，種類較多，包括黃酮類、酚酸類、花色苷類等。酚類化合物可以清除體內(nèi)自由基，具有較強(qiáng)的抗氧化活性以及預(yù)防與氧化應(yīng)激有關(guān)的疾病等作用。

小米品種不同，多酚的種類及含量也不同。本文以沁州黃小米為原料，采用超聲波輔助有機(jī)溶劑提取法，利用超聲波的空化效應(yīng)，使小米多酚與溶劑充分混合，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，以期得到沁州黃小米多酚的最佳提取工藝，為沁州黃小米資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沁州黃小米，山西省長治市武鄉(xiāng)縣。

沒食子酸，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Folin 試劑、石油醚、無水乙醇、無水碳酸鈉，均勻分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-5500 紫外分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；TDL6M型低速離心機(jī)，湖南湘立科學(xué)儀器有限公司；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；FA 1604 型電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；KQ-300GDV 超聲波清洗器，上海梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原料預(yù)處理

小米除雜后，用粉碎機(jī)粉碎，過篩（50 目），然后用石油醚按料液比1∶2 脫脂處理72 h，干燥箱干燥，備用。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

固定料液比1∶10，超聲時(shí)間40 min，超聲溫度40 ℃，研究乙醇體積分?jǐn)?shù)（50%、60%、70%、80%、90%） 對(duì)多酚得率的影響。

固定料液比1∶10，超聲溫度40 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，研究超聲時(shí)間（20 min、30 min、40 min、50 min、60 min） 對(duì)多酚得率的影響。

固定料液比1∶10，超聲時(shí)間40 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，研究超聲溫度（20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃） 對(duì)多酚得率的影響。

固定超聲溫度40 ℃，超聲時(shí)間40 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，研究料液比（1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14） 對(duì)多酚得率的影響。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用Design Exper10.0軟件Box-Benhnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以小米多酚得率為判定指標(biāo)，3 個(gè)較為顯著的因素為自變量設(shè)計(jì)因素水平表，見表1。

表1 響應(yīng)面因素水平表

1.3.4 多酚含量測定

依次取0.1 mg/mL 沒食子酸溶液0.0 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL 于50 mL容量瓶中，加入3 mL Folin 試劑，25 mL 蒸餾水，靜置5 min，加入9 mL10%的碳酸鈉溶液后定容至刻度。避光反應(yīng)30 min，以蒸餾水為空白對(duì)照，在760 nm 處測定吸光值。重復(fù)3 次測得出平均值，繪制多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線。

準(zhǔn)確量取5 mL 樣液，按照上述方法測定吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多酚含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線

以沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.097 4x-0.012 1，相關(guān)系數(shù)R2=0.993 7。

圖1 多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)多酚得率的影響

乙酚體積分?jǐn)?shù)對(duì)多酚得率影響結(jié)果見圖2。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)多酚得率的影響

由圖2 可以看出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)升高，多酚得率先升高后下降。乙醇體積分?jǐn)?shù)不同，提取溶劑的極性不同，導(dǎo)致溶出的有效成分不同，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，小米多酚得率最高。因此，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)70%較為適宜。

2.2.2 超聲時(shí)間對(duì)多酚得率的影響超聲時(shí)間對(duì)多酚得率的影響結(jié)果見圖3。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)多酚得率的影響

由圖3 中可以看出，多酚得率隨著提取時(shí)間的增加而升高，當(dāng)提取時(shí)間超過40 min，多酚得率逐漸下降。原因是提取時(shí)間過短，提取不充分，導(dǎo)致得率偏低；提取時(shí)間越長，超聲波產(chǎn)生的高速震動(dòng)空化效應(yīng)會(huì)破壞樣液中的多酚類物質(zhì)，使得率下降，并且提取時(shí)間過長，會(huì)使其他物質(zhì)溶出較多，不利于后續(xù)純化。因此選擇超聲時(shí)間40 min 較適宜。

2.2.3 超聲溫度對(duì)多酚得率的影響超聲溫度對(duì)多酚得率的影響結(jié)果見圖4。

圖4 超聲溫度對(duì)多酚得率的影響

由圖4 可以看出，隨著提取溫度升高，多酚得率先增加后下降，當(dāng)溫度為40 ℃時(shí)，多酚得率最高。溫度升高可以提高物質(zhì)的溶解度，然而溫度過高可能導(dǎo)致小米中多酚物質(zhì)被熱分解，破壞已經(jīng)提取出的多酚結(jié)構(gòu)，使多酚得率下降。因此，選擇超聲提取溫度40 ℃為宜。

2.2.4 料液比對(duì)多酚得率的影響

料液比對(duì)多酚得率影響結(jié)果見圖5。

圖5 料液比對(duì)多酚得率的影響

由圖5 可知，隨著提取溶劑體積的增加，多酚得率先升高后趁于平穩(wěn)。當(dāng)料液比超過1∶10 后，得率呈現(xiàn)穩(wěn)定趨勢。料液比達(dá)到一定程度時(shí)，多酚基本溶出，繼續(xù)增加料液比會(huì)造成原材料浪費(fèi)和經(jīng)濟(jì)損失。因此，選擇料液比1∶10 為宜。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 回歸模型的建立及方差分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，從中選取了3 個(gè)對(duì)得率影響顯著的因素進(jìn)行3 水平3 因素響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表2。以多酚得率為響應(yīng)值，得到二次回歸模型為： Y=73.83 ＋3.29A ＋0.68B－2.17C ＋1.70AB－3.84AC－0.36BC－11.91A2－7.78B2－7.58C2，其中A 為乙醇體積分?jǐn)?shù)，B 為超聲時(shí)間，C為超聲溫度。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 方差分析表

3 結(jié)論

通過單因素和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，得出超聲波輔助提取沁州黃小米多酚的最佳工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)72%，超聲時(shí)間41 min，超聲溫度38 ℃，在此工藝條件下多酚得率預(yù)測值為74.34 mg/100g，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果為74.34 mg/100g，接近預(yù)測值。說明該模型可以有效預(yù)測沁州黃小米多酚的超聲波提取工藝參數(shù)，為沁州黃小米多酚的提取及綜合利用提供一定的理論參考。

對(duì)模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。該模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.122 7），說明該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，能較好的預(yù)測小米多酚的得率。其決定系數(shù)RAdj2=0.958 6，說明該模型相關(guān)性較好。一次項(xiàng)A（乙醇體積分?jǐn)?shù)），交互作用項(xiàng)AC，二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)多酚得率影響極顯著（P＜0.01），一次項(xiàng)C（超聲溫度） 對(duì)多酚得率影響顯著（P＜0.05），其余因素影響不顯著。各個(gè)因素對(duì)多酚得率影響的主次順序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)＞超聲溫度＞超聲時(shí)間。

2.3.2 等高線圖及響應(yīng)曲面圖分析

圖6、圖7～8 見下頁分別為各個(gè)因素交互作用與響應(yīng)值之間的等高線及響應(yīng)曲面圖。由等高線圖可以看出，AC 交互作用的等高線最接近橢圓，響應(yīng)曲面最陡，所以AC 交互作用對(duì)得率的影響最顯著；BC 交互作用的等高線接近圓形，相應(yīng)曲面較平，說明BC 交互作用對(duì)得率的影響較小。

2.3.3 提取工藝優(yōu)化及驗(yàn)證試驗(yàn)

結(jié)合回歸方程和響應(yīng)面結(jié)果分析，超聲波輔助法提取小米多酚的最優(yōu)工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)71.727%，超聲時(shí)間40.671 min，超聲溫度38.117 ℃，此時(shí)得率為74.34 mg/100g?？紤]到實(shí)際操作，將工藝條件調(diào)整為乙醇體積分?jǐn)?shù)72%，超聲時(shí)間41 min，超聲溫度38 ℃，進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)，多酚得率平均值為74.13 mg/100g，與理論值基本吻合，說明該模型能較好的預(yù)測小米多酚得率。

圖6 超聲時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)多酚得率的影響

圖7 超聲溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)多酚得率的影響

圖8 超聲溫度和超聲時(shí)間對(duì)多酚得率的影響