伏立康唑滴眼液的含量測(cè)定及其開啟穩(wěn)定性

[中山大學(xué)中山眼科中心(眼科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)藥學(xué)部，廣州 510080]

真菌性角膜炎(fungal keratitis，F(xiàn)K)是一種發(fā)病迅速、治療棘手、破壞性極大的眼病，如得不到及時(shí)有效的治療，可發(fā)展至角膜潰瘍穿孔、眼內(nèi)感染、眼球萎縮，甚至致盲[1-2]。目前其治療方法以局部應(yīng)用抗真菌藥物為主，再結(jié)合全身用藥治療[3]。在臨床常用的局部抗真菌藥物中，那他霉素高效廣譜，但其穿透力較差，僅用于淺表感染的治療，且價(jià)格極其昂貴[4]；兩性霉素B雖然毒性強(qiáng)，但對(duì)我國(guó)FK常見的致病菌鐮孢菌屬無(wú)效[5-6]，且使用時(shí)對(duì)眼部刺激大；氟康唑眼內(nèi)通透性好刺激小，抗菌普廣，但抗菌效力較弱，療效差[7]。

隨著新三唑類抗真菌藥伏立康唑的批準(zhǔn)上市，其強(qiáng)大的抗菌活性和優(yōu)良的通透性為眼科真菌感染性疾病的治療帶來(lái)了新的曙光[8]。研究[9-12]表明：局部使用伏立康唑溶液點(diǎn)眼治療FK，能起到很好的治療效果；該溶液用于健康馬眼后，1.0%溶液的房水濃度明顯高于0.5%，而與3.0%的溶液房水濃度大致相同[13]。目前，還沒有商品化的伏立康唑眼用制劑上市。在獲得患者知情同意的情況下，中山大學(xué)中山眼科中心制劑室臨時(shí)配制濃度為1.0%的伏立康唑滴眼液用于臨床嚴(yán)重FK患者的緊急治療。為確保滴眼液含量的準(zhǔn)確可控，確保其含量在開啟使用的4周內(nèi)不發(fā)生大的變化，提高用藥的安全有效性，需建立一種準(zhǔn)確可靠的方法用于測(cè)定伏立康唑滴眼液含量，此外還需考察該滴眼液的開啟穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

實(shí)驗(yàn)采用Waters e2695高效液相色譜儀，包括Waters2489紫外檢測(cè)器及Waters Empower化學(xué)工作站(美國(guó)Waters公司)，BT-125D型電子天平(德國(guó)Sartorius公司)。試劑包括：伏立康唑?qū)φ掌?批號(hào)：100862-201903，含量：99.8%，中國(guó)食品藥品檢定研究院)，注射用伏立康唑(批號(hào)：19110105，珠海億邦制藥股份有限公司)，伏立康唑滴眼液(規(guī)格：10 mL:100 mg，批號(hào)：20052601，20060201，20060202，中山大學(xué)中山眼科中心制劑室)，乙腈為色譜純，乙酸銨、醋酸為分析純，水為注射用水。

1.2 含量測(cè)定方法

1.2.1 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以0.02 mol/L 醋酸銨緩沖液(用醋酸調(diào)節(jié)pH 值至4.0±0.3)-乙腈(55:45，V/V)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為256 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。

1.2.2 試液的配制

對(duì)照品溶液的制備：精密稱取伏立康唑?qū)φ掌?，用流?dòng)相溶解并稀釋，制成每1 mL中約含伏立康唑0.1 mg的對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備：精密量取伏立康唑滴眼液1 mL置于100 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，作為供試品溶液。

陰性樣品溶液的制備：取不含伏立康唑的陰性樣品，按供試品溶液配制法制得陰性樣品溶液。

1.2.3 專屬性試驗(yàn)

按“1.2.1”的色譜條件，分別記錄對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液的HPLC色譜圖。

1.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別取對(duì)照品溶液(0.107 mg/mL)和供試品溶液(約0.1 mg/mL)，置室溫環(huán)境下放置，在0，2，4，6，8，12 h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。

1.2.5 精密度

取同一對(duì)照品溶液，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次；另取同一批號(hào)(批號(hào)：20052601)的伏立康唑滴眼液樣品6份，按供試品溶液制備方法處理后，測(cè)定伏立康唑的含量。

1.2.6 線性關(guān)系

精密稱取伏立康唑?qū)φ掌愤m量，用流動(dòng)相溶解，得到濃度為1.0621 mg/mL的伏立康唑?qū)φ掌穬?chǔ)備液。分別精密量取儲(chǔ)備液0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mL置10 mL量瓶中，加入流動(dòng)相稀釋至刻度，得到濃度分別為0.0425，0.0637，0.0850，0.1062，0.1274，0.1487 mg/mL的對(duì)照品溶液，分別精密量取10 μL注入液相色譜儀，按“1.2.1”項(xiàng)下的色譜條件，測(cè)定峰面積并記錄色譜圖。

1.2.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密吸取不含伏立康唑的陰性樣品1 mL置100 mL 容量瓶中，分別精密加入濃度為1.0621 mg/mL的伏立康唑?qū)φ掌穬?chǔ)備液8，10，12 mL，用流動(dòng)相稀釋至刻度，每個(gè)濃度配制3份，得到含伏立康唑?yàn)橐?guī)定量80%，100%，120%的回收率測(cè)定溶液各3份，共9份。按“1.2.1”方法測(cè)定，計(jì)算回收率。

1.2.8 耐用性試驗(yàn)

在試驗(yàn)中對(duì)柱溫、流速進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，分別測(cè)定伏立康唑滴眼液(批號(hào)：20052601)的含量，以考察方法的耐用性。分別在柱溫為30 ℃，35 ℃，40 ℃及流速為0.8，1.0，1.2 mL/min條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其他色譜參數(shù)不變。

1.2.9 樣品含量測(cè)定

取本品，按照供試品溶液配制方法制備，測(cè)定其主藥含量，按外標(biāo)法以峰面積以計(jì)算，含量應(yīng)為標(biāo)示量的90.0%～110.0%。

1.3 開啟穩(wěn)定性

為進(jìn)一步確保伏立康唑滴眼液的質(zhì)量，筆者對(duì)該滴眼液開啟后，按每天4次的頻率模擬臨床患者使用，每次用完后擰緊瓶蓋，再將剩余的滴眼液分別在2～8 ℃，25 ℃，40 ℃環(huán)境中貯存。連續(xù)4周對(duì)該滴眼液的開啟使用的穩(wěn)定性進(jìn)行考察。

2 結(jié)果

2.1 專屬性試驗(yàn)

供試品溶液與對(duì)照品溶液在相同的保留時(shí)間下出現(xiàn)伏立康唑的峰，峰形對(duì)稱，無(wú)相鄰雜質(zhì)峰，陰性樣品溶液在此保留時(shí)間處無(wú)色譜峰出現(xiàn)，表明處方中其他成分對(duì)伏立康唑的測(cè)定無(wú)干擾(圖1)。

2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

穩(wěn)定性試驗(yàn)中，6個(gè)時(shí)間點(diǎn)下對(duì)照品溶液峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviatio，RSD)為0.14%，供試品溶液峰面積的RSD 為0.17%。表明在室溫條件下對(duì)照品溶液和供試品溶液在12 h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.3 精密度

對(duì)照品溶液，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積RSD為0.08%(n=6)，低于可接受標(biāo)準(zhǔn)(RSD ＜2%)，表明儀器精密度良好；6份供試品溶液的平均含量為97.8%，RSD為0.18%，低于可接受標(biāo)準(zhǔn)(RSD＜2%)，表明本方法重復(fù)性良好。

2.4 線性關(guān)系及回收率

以濃度(X，mg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為：Y=12006824.3400X+8666.5238 (r=0.9999)。結(jié)果表明：伏立康唑在0.0425～0.1487 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

9 份溶液的平均回收率為99.97%，RSD 為0.12%，結(jié)果顯示：3個(gè)濃度下伏立康唑的平均回收率均為98.0%～102.0%，9個(gè)回收率數(shù)據(jù)的RSD均小于2.0%，表明含量測(cè)定方法可靠(表1)。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of adding sample recovery

2.5 耐用性試驗(yàn)

耐用性試驗(yàn)結(jié)果顯示柱溫及流速對(duì)伏立康唑含量測(cè)定結(jié)果影響較小(表2)。

表2 耐用性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of durability test

2.6 樣品含量測(cè)定

3 批制劑測(cè)試結(jié)果見表3，含量均在標(biāo)示量90.0%～110.0%的范圍內(nèi)，符合規(guī)定。

2.7 開啟穩(wěn)定性考察

4周內(nèi)3種環(huán)境下貯存的滴眼液均為無(wú)色的澄明液體，無(wú)可見異物。pH值穩(wěn)定在6.1～6.2，滲透壓穩(wěn)定在545 mOsmol/kg左右，25 ℃條件下含量基本不變，2～8 ℃和40 ℃含量略微出現(xiàn)下降，也能保持在98%以上(表4)。此外，在第0周和第4周對(duì)開啟使用的滴眼液進(jìn)行了無(wú)菌檢驗(yàn)，結(jié)果符合規(guī)定。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該滴眼液開啟使用4周，穩(wěn)定性良好。

表3 三批伏立康唑滴眼液的含量測(cè)定結(jié)果Table 3 Three batches analysis results of voriconazole eye drops

表4 伏立康唑滴眼液的開啟穩(wěn)定性Table 4 Stability of voriconazole eye drops after opening

3 討論

參考研究[14-16]，筆者對(duì)流動(dòng)相的組分比例進(jìn)行了優(yōu)化和篩選，改良了伏立康唑滴眼液的高效液相色譜檢測(cè)方法。經(jīng)方法學(xué)試驗(yàn)驗(yàn)證，該測(cè)定方法穩(wěn)定好，準(zhǔn)確度高，回收率好，可以有效控制其滴眼液的質(zhì)量。開啟穩(wěn)定性研究結(jié)果表明：中山大學(xué)中山眼科中心臨時(shí)配制的伏立康唑滴眼液打開后按4次/d的使用頻次，每次用完蓋好，放置在不用的環(huán)境保存4周，穩(wěn)定性良好，能滿足其在臨床嚴(yán)重真菌感染患者中緊急使用的要求。

相比其他伏立康唑的測(cè)定方法，如紫外吸收光譜、酶聯(lián)免疫分析等，HPLC法的特異性更好，精密度更高，測(cè)試結(jié)果更精準(zhǔn)，在藥物分析檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)揮不可替代的作用。本研究存在的不足之處是在穩(wěn)定性試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)，針對(duì)該臨配滴眼液只考察了其開啟穩(wěn)定性，考慮到本品滲透壓偏高，還需繼續(xù)優(yōu)化滴眼液的處方工藝后，配制出可批量生產(chǎn)、質(zhì)量更優(yōu)的院內(nèi)制劑，再進(jìn)一步對(duì)伏立康唑滴眼液的穩(wěn)定性進(jìn)行全面考察。