miR-411-5p 在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其細(xì)胞生物學(xué)功能分析

易深根 劉波 鄭瑛 甘偉 劉奎杰 曾嘉 曾蓉 陳翔 歐陽(yáng)國(guó)慶 陳衛(wèi)東（通訊作者）

（中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院 湖南 長(zhǎng)沙 410000）

結(jié)直腸癌是臨床中發(fā)病率及死亡率均較高的一種惡性腫瘤，其中復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是患者死亡的重要原因[1]。由于結(jié)直腸癌早期缺乏典型臨床癥狀，且臨床上缺乏早期診斷的特異性生物分子標(biāo)志物，因而大多數(shù)患者確診時(shí)已經(jīng)處于中晚期。近年來(lái)，隨著分子檢測(cè)手段的不斷發(fā)展進(jìn)步，惡性腫瘤相關(guān)基因表達(dá)情況已經(jīng)成為臨床研究的一個(gè)熱點(diǎn)。微小RNA（mi-RNA）具有多種生物學(xué)功能，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移、死亡、組織代謝、個(gè)體發(fā)育以及神經(jīng)細(xì)胞分化等[2]。研究顯示[3]，miR-411-5p 在膀胱癌、胃癌、宮頸癌、乳腺癌中均出現(xiàn)異常表達(dá)。本研究通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Q-PCR）對(duì)結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中miR-411-5p表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，旨在分析其與臨床病理特征的關(guān)系，及其對(duì)細(xì)胞生物學(xué)功能的影響?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

選取醫(yī)院2019 年1 月—2020 年4 月接受手術(shù)治療的結(jié)直腸癌患者50 例作為研究對(duì)象，手術(shù)切除患者結(jié)直腸癌組織作為結(jié)直腸癌組，選取距病灶邊緣＞5cm 的癌旁組織作為癌旁組，所有癌旁組織均經(jīng)術(shù)后病理學(xué)檢查無(wú)癌組織殘留。詳細(xì)收集患者的一般資料，主要包括年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤直徑、TNM 分期、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。50 例患者中男性29 例，女性21 例；年齡34 ～78 歲，平均年齡（60.29±7.46）歲；腫瘤部位：直腸26 例，結(jié)腸24 例；TNM 分期：Ⅰ期11 例，Ⅱ期14 例，Ⅲ期17 例，Ⅳ期8 例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21 例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29 例。

1.2 方法

1.2.1 材料及儀器 結(jié)直腸癌細(xì)胞株DLD1 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，熒光定量PCR 儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司，靶基因引物、RPMI-1640、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)HyClone 公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、轉(zhuǎn)染試劑盒、miR-411-5p negative、miR-411-5p mimic 由上海吉瑪公司提供。

1.2.2 Q-PCR 測(cè)定miR-411-5p 相對(duì)表達(dá)量 取大小適宜的結(jié)直腸癌組織和癌旁組織，通過(guò)TRizol 法提取RNA，濃度測(cè)定之后使用逆轉(zhuǎn)試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，取1μL 的cDNA，通過(guò)PCR 試劑盒擴(kuò)增及檢測(cè)miR-411-5p 的表達(dá)，以2-ΔΔCt 計(jì)算miR-411-5p 相對(duì)表達(dá)量。PCR 反應(yīng)體系總體積為20μl，PCR 擴(kuò)增：95℃預(yù)變性，時(shí)間為5min，變性40s，退火至60℃，時(shí)間維持40s，再延伸至72℃，時(shí)間持續(xù)40s，重復(fù)循環(huán)40 次。上游引物的序列為5’-GCTCCGGTAGGTCACG-3’，下游引物的序列為5’-CCTGGGTCAAGTGTCGGAG-3’。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將結(jié)直腸癌細(xì)胞株DLD1 培養(yǎng)于含有1%青鏈霉素、10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，放置于5%二氧化碳飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，溫度控制在37℃，按照轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分為轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組和空白組。

1.2.4 Transwell 實(shí)驗(yàn) （1）遷移實(shí)驗(yàn)：取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h 細(xì)胞，于胰酶消化之后收集細(xì)胞，使用無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸，配制成為2×105/ml 細(xì)胞懸液，取200μL 放置于Transwell 小室上室，將800μl 的含有20%胎牛血清的培養(yǎng)液加入Transwell 小室下室，放置于二氧化碳體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱，溫度控制在37℃，時(shí)間為24h。將室內(nèi)液體傾去，再放置于4%多聚甲醛溶液中固定30min，溫度為室溫，在風(fēng)干之后取2%結(jié)晶紫進(jìn)行染色，時(shí)間為30min，將聚碳脂膜內(nèi)側(cè)面的細(xì)胞擦去，于顯微鏡下對(duì)外側(cè)面細(xì)胞進(jìn)行觀察，隨機(jī)選取5 個(gè)高倍鏡視野，對(duì)穿膜細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，每組各3 個(gè)復(fù)孔；（2）于低溫條件下將無(wú)血清培養(yǎng)基調(diào)制為1mg/mL 的Matrigel 膠溶液，均勻鋪于Transwell 上室，在風(fēng)干之后以備用。剩余步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.3 觀察指標(biāo)

（1）比較結(jié)直腸癌組和癌旁組miR-411-5p 相對(duì)表達(dá)量；（2）分析結(jié)直腸癌患者臨床病理特征與miR-411-5p 相對(duì)表達(dá)量的關(guān)系；（3）比較miR-411-5p 轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組和空白組對(duì)癌細(xì)胞侵襲、遷移能力。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料應(yīng)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)和方差分析，計(jì)數(shù)資料與百分?jǐn)?shù)（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組和癌旁組miR-411-5p 相對(duì)表達(dá)量比較

結(jié)直腸癌組miR-411-5p 相對(duì)表達(dá)量為（0.78±0.23），顯著低于癌旁組的（1.94±0.27），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-23.126，P＜0.05）。

2.2 結(jié)直腸癌患者臨床病理特征與miR-411-5p 相對(duì)表達(dá)量的關(guān)系

miR-411-5p 在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)與年齡、性別、腫瘤直徑以及腫瘤部位無(wú)關(guān)（P＞0.05），與TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織分化程度相關(guān)（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 結(jié)直腸癌患者臨床病理特征與miR-411-5p 相對(duì)表達(dá)量的關(guān)系（±s）

表1 結(jié)直腸癌患者臨床病理特征與miR-411-5p 相對(duì)表達(dá)量的關(guān)系（±s）

項(xiàng)目 例數(shù) miR-411-5p 相對(duì)表達(dá)量 t 值 P 值性別男29 0.81±0.25 1.027 0.310女21 0.74±0.22年齡（歲）＜60 18 0.82±0.27 1.531 0.132≥60 32 0.72±0.19 TNM 分期Ⅰ期+Ⅱ期 25 0.89±0.28 3.816 0.000Ⅲ期+Ⅳ期 25 0.64±0.17組織分化程度高分化+中分化 36 0.93±0.29 3.791 0.000低分化 14 0.62±0.15腫瘤直徑（cm）＜5 22 0.83±0.24 1.152 0.255≥5 28 0.76±0.19淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有21 0.59±0.16 -5.919 0.000無(wú)29 1.04±0.32腫瘤部位直腸 26 0.75±0.19 -1.513 0.137結(jié)腸 24 0.84±0.23

2.3 miR-411-5p 上調(diào)對(duì)癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

轉(zhuǎn)染組遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著低于陰性對(duì)照組和空白組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；陰性對(duì)照組和空白組遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 miR-411-5p 上調(diào)對(duì)癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響（±s，個(gè)）

表2 miR-411-5p 上調(diào)對(duì)癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響（±s，個(gè)）

注：與轉(zhuǎn)染組比較，aP ＜0.05。

組別 遷移細(xì)胞數(shù) 侵襲細(xì)胞數(shù)轉(zhuǎn)染組 75.28±8.34 84.87±7.14陰性對(duì)照組 136.49±26.83a 152.26±29.05a空白組 141.56±28.69a 157.19±31.78a F 值 31.047 46.452 P 值 0.000 0.000

3.討論

在惡性腫瘤及其發(fā)病機(jī)制當(dāng)中，mi-RNA 所起到的作用越來(lái)越受到專(zhuān)家學(xué)者的重視[4]。近年來(lái)，隨著相關(guān)研究技術(shù)的進(jìn)步以及認(rèn)識(shí)的不斷深入，人們對(duì)結(jié)直腸癌mi-RNA 的研究已經(jīng)取得了較大的進(jìn)展，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種與惡性腫瘤病理過(guò)程有密切關(guān)系的mi-RNA，如mi-RNA-98、mi-RNA-3960 等[5]。mi-RNA 幾乎參與了絕大多數(shù)細(xì)胞生物學(xué)的進(jìn)程，包括細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移、增殖、分化、凋亡等。mi-RNA 可通過(guò)調(diào)控靶基因、激活受體蛋白以及結(jié)合功能蛋白等方式影響惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展。

研究顯示[6-7]，miR-411-5p 在肝癌等惡性腫瘤中呈低表達(dá)，且在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移早期診斷中具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組miR-411-5p 相對(duì)表達(dá)量顯著低于癌旁組，表明結(jié)直腸癌組織中miR-411-5p 相對(duì)表達(dá)量較低。mi-RNA與惡性腫瘤發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)，本研究結(jié)果顯示，miR-411-5p在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)與年齡、性別、腫瘤直徑以及腫瘤部位無(wú)關(guān)，與TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織分化程度相關(guān)，說(shuō)明miR-411-5p 可以在一定程度上反映膀胱癌患者TNM 分期、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，可作為患者病情進(jìn)展情況評(píng)估的重要指標(biāo)。

臨床中，大多數(shù)惡性腫瘤患者死亡的主要原因?yàn)椴≡钷D(zhuǎn)移及侵襲，因而了解癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移機(jī)制具有重要意義。吳克盛等[8]的研究指出，上調(diào)miR-411-5p 表達(dá)可以抑制胃癌細(xì)胞遷移。本研究中，轉(zhuǎn)染組遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著低于陰性對(duì)照組和空白組，說(shuō)明特異性上調(diào)miR-411-5p 表達(dá)可以有效減少結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲及遷移能力，提示miR-411-5p 可能影響了結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲及遷移。

綜上所述，結(jié)直腸癌組織中miR-411-5p 相對(duì)表達(dá)量較低，與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，且表達(dá)水平上調(diào)可以抑制癌細(xì)胞的侵襲以及轉(zhuǎn)移。不過(guò)由于結(jié)直腸癌發(fā)生涉及多步驟及多基因，miR-411-5p 在發(fā)生及進(jìn)展中的作用機(jī)制需要進(jìn)一步研究。