基于高通量測序重茬草莓土壤細菌和真菌多樣性分析

肖 蓉,張春芬,鄧 舒

(山西農業(yè)大學果樹研究所,山西 太原 030031)

生產中大棚草莓種植每年都要換新苗,因此重茬在所難免。連作障害是制約草莓發(fā)展的最大因素,據調查,連作4年草莓能減產40%以上[1]。目前,大家公認的連作障害的形成機理主要包括連作土壤中病原微生物積累[2]、土壤營養(yǎng)元素失衡[3]、化感作用[4-6]3個方面。而土壤微生態(tài)失衡是研究者所公認的連作障害發(fā)生的根本。其中微生物因素在整個連作障礙發(fā)生發(fā)展過程中一直扮演著關鍵角色。

在土壤這個黑匣子中到底有多少微生物,以及他們之間的結構信息、群體相互作用、與植物重茬障礙之間的關系等等吸引著人們持續(xù)而深入的研究。由于目前土壤中可培養(yǎng)的微生物僅占土壤微生物總數的1%左右,因此依賴于平板培養(yǎng)技術來研究土壤微生物生態(tài)顯然是不夠的[7]。近些年來,隨著現代生物技術和基因組學的蓬勃發(fā)展,以土壤中全部微生物基因組DNA序列為依據的微生物分子生態(tài)學研究方法正日益成為大家普遍接受的方法[8]。

本研究以同一個農業(yè)園區(qū)新茬草莓大棚和連作3年的重茬草莓大棚土壤為研究對象,直接提取草莓根際土壤總DNA,通過Illumina Miseq測序平臺對新茬土壤及重茬土壤細菌和真菌結構及功能多樣性進行比較分析,旨在找到重茬土壤中的優(yōu)勢細菌和真菌類群,從微生物生態(tài)學角度研究草莓重茬障害發(fā)作時的生物學病因,為草莓重茬障礙防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試土樣

土壤樣品采自山西省太原市陽曲縣同一個農業(yè)園區(qū)新茬草莓大棚和連作3年的重茬草莓大棚,于6月草莓剛收獲結束后采樣。每個大棚內按“S”形于大棚中間隨機挑選草莓植株4株,整株挖出置于冰盒中用無菌袋帶回實驗室,抖掉根部多余的土后用無菌毛刷刷取根際土,4個土樣混合成1個樣置于無菌離心管中,新茬土壤樣品命名為XJS1,重茬土壤樣品命名為CJS1。各類型選取4座大棚為采樣地,共獲得XJS1和CJS1樣本各4個,視為4次重復。

1.2 土壤微生物總DNA提取及測序

土壤微生物總DNA提取方法參考本課題組前期方法[9]。用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性后用Nanodrop 2000分光光度計測定其濃度,DNA合格樣品送生工生物工程(上海)股份有限公司完成后續(xù)多樣性測序工作。細菌多樣性測序選取V3-V4區(qū)作為靶向擴增區(qū)域,真菌多樣性測序選取ITS1-ITS2區(qū)作為靶向擴增區(qū)域。

1.3 數據處理與分析

采用Excel軟件對各樣本豐富度進行分析。

2 結果與分析

2.1 細菌多樣性分析

2.1.1 多樣性指標

原始測序數據通過質控后,新茬大棚土壤(XJS1)中共獲得33 198條序列,分歸于24 968個OTUs;3年重茬大棚土壤(CJS1)中共獲得29 399條序列,分歸于23 307個OTUs。表1展示了兩種大棚土壤的細菌多樣性,可見,新茬大棚土壤的Shannon指數為8.092 6,Simpson指數為0.001 6,Chao-1指數為24 863;重茬大棚土壤的這3個多樣性指數分別為7.583 1、0.008 7和23 415。Shannon指數常用來綜合體現物種豐富度和均勻度;Simpson指數被用來評估環(huán)境中微生物多樣性,其數值越大代表樣本群落多樣性越低;Chao-1指數在生態(tài)學中也是估計物種種數的常用指標。根據OTUs數目及多樣性指標可以看出,重茬3年后土壤中細菌物種多樣性及豐富度降低。

表1 土壤中細菌的多樣性指數

2.1.2 門水平上豐富度差異分析

經過軟件RDP classifier處理后,對所有序列進行細菌群落分類。新茬土壤中共涉及到29個門,重茬土壤中共涉及到25個門。圖1和圖2是兩種土壤類型中的優(yōu)勢細菌在門水平的豐度占比分布圖。可知,未分類的細菌群(Unclassified),在兩種生境中均占比很大,分別占17.04%和24.48%,說明土壤中還有許多未可培養(yǎng)的細菌。除了這類細菌外,變形菌門(Proteobacteria)在兩種生境中均是豐度第一的優(yōu)勢細菌,在新茬土壤中與重茬土壤中豐度分別占51.39%和50.44%;其次是擬桿菌門(Bacteroidetes),分別占17.09%和13.21%;另外,疣微菌門(Verrucomicrobia)、厚壁菌門(Firmicutes)、浮霉菌門(Planctomycetes)和疣微菌門(Verrucomicrobia)在兩種生境中的豐度值均高于1%。新茬土壤中豐度值高于1%的還有酸桿菌門(Acidobacteria,2.23%)和綠彎菌門(Chloroflexi,1.21%)。其余各類群所占比例較少。

圖1 新茬土門水平細菌豐度占比分布圖

圖2 重茬土門水平細菌豐度占比分布圖

2.1.3 屬水平上上豐富度差異分析

從屬水平看,新茬土壤中共涉及到831個屬,豐度值高于1%的屬有17個。重茬土壤中共涉及到817個屬,豐度值高于1%的屬有15個。說明新茬土中細菌多樣性高于重茬土。圖3展示了新茬土壤與重茬土壤優(yōu)勢細菌類群豐度分布?？梢?在各屬上,兩種生境中豐富度含量也有差異:在新茬土中,豐度最高的前3位是鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas)、根瘤菌(Rhizobium)、假單胞菌(Pseudomonas),豐度值分別占6.16%、5.28%、4.91%;在重茬土中,豐度最高的前3位是節(jié)桿菌(Arthrobacter)、Olivibacter、根瘤菌,豐度值分別占16.22%、8.20%、6.14%。與新茬土相比,重茬土中鞘氨醇單胞菌、地桿菌(Pedobacter)和Skermanella豐度顯著降低,分別由6.16%、4.78%和4.26%降低為2.33%、0.09%和0.66%;重茬土中節(jié)桿菌和腸桿菌(Enterobacter)豐度顯著升高,分別由4.78%、1.34%升高為16.22%、5.86%。

圖3 新茬土壤(XJS1)與重茬土壤(CJS1)優(yōu)勢細菌類群屬水平豐度分布圖注:XJS1指新茬大棚土壤;CJS1指重茬大棚土壤。

2.2 真菌多樣性分析

2.2.1 多樣性指標

新茬大棚土壤中共獲得23 377條序列,分歸于795個OTUs;3年重茬大棚土壤中共獲得22 484條序列,分歸于881個OTUs。表2展示了兩種大棚土壤的真菌多樣性指數,可見,重茬3年后土壤中真菌類群OTU數量、Shannon指數、Chao1指數均升高,Simpson指數降低,表明重茬3年后土壤中真菌物種多樣性增大。

表2 土壤中真菌的多樣性指數

2.2.2 門水平上豐富度差異分析

從門水平上看,新茬土壤與重茬土壤中分別檢測到26.87%和5.69%的unclassified和unclassified-Fungi,說明兩種生境中均含有較多的未知菌,但相對而言,重茬土壤中未知菌較少。除此之外,子囊菌門(Ascomycota)為兩種生境中的第一優(yōu)勢菌,新茬土壤中與重茬土壤中豐度分別占61.14%和72.60%;新茬土壤中豐度排名第二的為擔子菌門(Basidiomycota),占11.36%,該菌在重茬土壤中豐度占比下降為8.57%;兩組差異較大的菌為接合菌門(Zygomycota),該菌在新茬土壤中含量很低,豐度僅占0.54%,但重茬3年后的土壤中該菌豐度快速增長至13.08%。

圖4 新茬土壤(XJS1)與重茬土壤(CJS1)優(yōu)勢真菌類群門水平豐度分布圖注:XJS1指新茬大棚土壤;CJS1指重茬大棚土壤。

2.2.3 屬水平上上豐富度差異分析

圖5是新茬土壤與重茬土壤真菌在屬水平上的聚類條形圖,可以看出兩種生境中的各個樣本各自聚為一類,真菌組成和豐度有明顯的差異。具體來看,新茬土壤中真菌共檢測到94個屬,重茬土壤中真菌共檢測到101個屬。新茬土壤中豐度值高于1%的屬只有8種,而重茬土壤中有14種。說明經過3年重茬種植草莓后,土壤中真菌總的多樣性增多,且某些類群真菌大量增加。另外,新茬土壤中unclassified和unclassified_Fungi類群豐度比例總共占65.96%,重茬土壤中這兩大類群占48.72%,二者差異顯著,說明在新茬土中非培養(yǎng)真菌或未被人類分離獲得的真菌比例較高,重茬3年后,土壤中這類真菌比例降低,而人們所熟悉的、已獲得純培養(yǎng)物的真菌種類豐度增高。

圖5 新茬土壤(XJS1)與重茬土壤(CJS1)真菌在屬水平上的聚類圖注:XJS1指新茬大棚土壤;CJS1指重茬大棚土壤。

圖6是新茬土壤與重茬土壤中屬水平上豐度值比例大于1%的優(yōu)勢真菌類群分布圖?？梢?在新茬土壤中占優(yōu)勢的Cadophora、鏈格孢屬(Alternaria)、莖點霉屬(Phoma)、柄孢殼菌屬(Podospora)和Athelia屬真菌在重茬土壤中均不再占優(yōu)勢,Athelia屬在重茬土中沒有被檢測到。取而代之,在重茬土壤中占優(yōu)勢的真菌為青霉菌屬(Penicillium)、被孢霉屬(Mortierella)、枝頂孢屬(Acremonium)、枝孢屬(Cladosporium)、Plectosphaerella、unclassified-Ascomycota、鐮刀菌屬(Fusarium)、絲核菌屬(Rhizoctonia)、輪枝菌屬(Verticillium)和赤霉菌屬(Gibberella)等。兩種生境中的真菌菌群呈現明顯差異。

圖6 新茬土壤(XJS1)與重茬土壤(CJS1)優(yōu)勢真菌類群屬水平豐度分布圖注:XJS1指新茬大棚土壤;CJS1指重茬大棚土壤。

3 結論與討論

本研究結果表明,重茬3年后土壤中細菌數量減少、真菌數量上升,這與前人的研究結果相似。甄文超等研究指出,連續(xù)種植草莓的農田土壤微生態(tài)環(huán)境有利于真菌的增殖而不利于細菌和放線菌,草莓根際和根表微生物真菌種群數量上升、細菌和放線菌的增殖減少,最終導致連作障礙發(fā)生[10]。薛超指出重茬土壤微生物從細菌主導型向真菌主導型轉化[11]。

本研究結果表明,重茬3年后,新茬土壤中豐度最高的鞘氨醇單胞菌被節(jié)桿菌屬取代,腸桿菌屬豐度顯著升高。王志剛從植物根際獲得一株鞘氨醇單胞菌,能高效解磷和分泌IAA,促進連作西瓜生長[12]。另外,很多文獻都指出鞘氨醇單胞菌和節(jié)桿菌與多環(huán)芳烴、苯酚、菲等芳香族污染物的降解有關[13-15]。而腸桿菌具有緩解鎘-砷富集對植物的脅迫[16]、降解植物的次生代謝產物縮合單寧(原花青素)[17]、降解除草劑阿特拉津的功能[18, 19]。因此,這可能暗示該園區(qū)土壤中有有機物污染。

本研究發(fā)現,重茬3年后的土壤真菌優(yōu)勢菌與新茬土壤大相徑庭。原來在新茬土壤中占優(yōu)勢的真菌豐度值大幅下降,而新崛起的豐度值增高的真菌大多與植物病害發(fā)生相關。比如重茬土壤中占優(yōu)勢的絲核菌能引起多種植物(包括草莓)的黑根病、立枯病、葉腐病、莖腐等病害,是植物真菌病害防治的主要對象,也是草莓產區(qū)普遍發(fā)生的病害之一[20];輪枝菌屬導致黃萎病[21];鐮刀菌屬可危害多種植物,破壞植物的維管束系統(tǒng),引起植物萎蔫死亡和器官腐爛,是生產上防治最艱難的土傳病害之一,在草莓上可引起枯萎病[22]。另一類占據優(yōu)勢地位的菌是營腐生生活的菌屬,比如青霉菌和接合菌,這類菌常生長在腐爛的蔬菜、水果、肉類和各種潮濕的有機物上。由此可以推測:重茬3年的草莓地土壤中積累了相當數量的植物病原菌,殘枝敗葉的積累養(yǎng)育著一批腐生菌,土壤真菌環(huán)境不容樂觀。另外,值得注意的是,該園區(qū)新茬土壤中檢測到優(yōu)勢菌鏈格孢菌和莖點霉屬細菌,鏈格孢菌能夠引起植物黑斑病、腐爛病等,也能引起草莓采后黑腐病[23];莖點霉菌寄主廣泛,能夠引起多種植物葉斑病、莖枯病等,其中部分種是檢疫性植物病原菌[24],提示該地塊雖然是第1年栽種草莓,但前茬作物留下的病原菌也不容忽視。

綜上所述,對于細菌來講,重茬3年后土壤中細菌物種多樣性及豐富度降低;變形菌門和擬桿菌門是兩種生境中的優(yōu)勢細菌;在屬水平上,新茬土中,豐度最高的前3位是鞘氨醇單胞菌、根瘤菌和假單胞菌,而在重茬土中,豐度最高的前3位是節(jié)桿菌、Olivibacter和根瘤菌;與新茬土相比,重茬土中鞘氨醇單胞菌、地桿菌和Skermanella豐度顯著降低,而節(jié)桿菌和腸桿菌豐度顯著升高。對于真菌來講,重茬3年后土壤中真菌物種多樣性增大;在門水平上,子囊菌門為兩種生境中的第一優(yōu)勢菌;接合菌門在新茬土壤中含量很低,但重茬3年后的土壤中該菌豐度快速增長;在屬水平上,新茬土壤中含有植物病原菌鏈格孢菌和莖點霉菌,重茬3年后枝頂孢屬、被孢霉屬、鐮刀菌屬等病原菌大量積累。因此,重茬土壤中細菌多樣性降低、真菌多樣性增高,病原真菌積累是引起草莓連作障礙的主要原因。