有氧運動通過心肌細胞吞運內皮細胞來源外泌體抑制細胞凋亡

吳方南，李 卓，田振軍*

（1.陜西師范大學 體育學院暨運動生物學研究所，陜西 西安 710119；2.西安交通大學生命科學與技術學院，陜西 西安 710049）

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是危害人類生命健康的嚴重疾病之一，MI后心肌出現(xiàn)缺血缺氧和炎癥反應，心臟梗死區(qū)出現(xiàn)缺血性壞死，伴隨心肌細胞凋亡，導致心功能明顯下降（Jinatongthai et al.，2017；Reed et al.，2017）。心梗的預防和康復手段是國內外臨床醫(yī)師和學者們高度關注的問題。臨床研究發(fā)現(xiàn)，適宜的運動訓練改善MI心臟心功能，降低心肌梗死的復發(fā)率及死亡率（Asaria et al.，2017）。動物實驗證實，運動訓練抑制心肌細胞凋亡，促進血管新生并減緩心肌纖維化，增強大鼠心功能（Cai et al.，2018；Xi et al.，2016），因此，適宜的運動鍛煉能作為心梗后康復的有效手段，但運動康復的作用靶點及其機制仍需研究完善。

外泌體（exosome）是由細胞分泌產生的大小為30～150 nm的小膜泡。多種細胞在正常及病理狀態(tài)下產生核內體，經細胞內溶酶體微粒內陷產生多囊泡體，多囊泡體外膜與細胞膜融合后釋放到細胞外環(huán)境形成外泌體，因此在機體的血液、汗液、尿液、唾液等體液中存在大量的外泌體（El Andaloussi et al.，2013；Tkach et al.，2016）。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體是細胞間通訊的重要途徑，作為生物信息的載體，其包含諸多miRNAs、DNA和蛋白質等生物信息物質?，F(xiàn)有研究認為，外泌體可作為載體遞送蛋白，調節(jié)細胞內通訊，促進心臟肥大（Datta et al.，2017）；心包液中的外泌體富含的miRNAs具有促進血管新生的作用（Beltra‐mi et al.，2017）；外泌體也可以作為蛋白藥物載體，運輸特定靶點蛋白（Cho et al.，2018；Dougherty et al.，2017）。外泌體作為參與體內細胞間運輸、信息交換和物質循環(huán)的重要載體，鮮見其在運動促進心梗心臟的康復中發(fā)揮重要作用的研究。

外泌體作為囊泡運輸調節(jié)機制的重要途徑，在體內循環(huán)、免疫、神經調節(jié)等生理過程中發(fā)揮重要作用。研究表明，不同運動方式均可激活體內能量代謝關鍵蛋白激酶AMPK，對此，在細胞實驗中，采用AMPK激動劑AICAR干預，模擬細胞的運動刺激（Narkar et al.，2008），探討AICAR干預促進H9C2細胞吞運HUVEC細胞來源外泌體抑制細胞凋亡的可能途徑。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

主要儀器：Bio-Rad電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)、Leica倒置熒光顯微鏡、Olympus正置光學顯微鏡、VINNO6心動彩超儀、小動物運動跑臺等。

主要試劑：AICAR（selleck，S1802）、LPS（Sigma，L4130）、PKH26（上海宇玫博）、外泌體抽提試劑盒（上海宇玫博）、CD9（abcam，ab236630）、CD81（abcam，ab79559）、Bcl-2（CST，#15071）、Bax（abcam，ab32503）、cleaved-Caspase3（abcam，ab2303）等。

1.2 動物分組及運動方案

動物分組：在西安交通大學動物飼養(yǎng)中心購得C57/BL6小鼠24只，隨機分成3組，每組8只。分組包括假心梗組（S組）、心梗組（MI組）和心梗運動組（ME組）。適應性飼養(yǎng)1周后對MI組和ME組進行左心室冠狀動脈前降支結扎（left anterior descending of the coronary artery,LAD）手術制備心梗模型，S組小鼠僅開胸穿線，不結扎，作為手術對照。

運動方案：術后休息1周，對ME組小鼠進行6周跑臺運動，運動方案為：12 m/min，60 min/天，5天/周×6周（Schefer et al.，1996）。

1.3 小鼠心動超聲檢測及取材

心動超聲檢測：小鼠運動結束后異氟醚麻醉，備皮后手術臺固定，使用小鼠超聲探頭獲取心臟長軸M型超聲圖，測量左心室收縮末期內徑（left ventricular internal dimension systole，LVIDs）和左心室舒張末期內徑（left ventricular internal dimension diastolic，LVIDd），軟件計算左心室短軸縮短率（fractional shortening，F(xiàn)S）和射血分數(shù)（ejection fractions，EF）。

心臟取材：6周運動結束24 h后，小鼠進行異氟醚麻醉并固定，低溫環(huán)境開胸迅速摘取心臟于液氮或甲醛保存。液氮凍存的心臟組織用于分子檢測，甲醛固定的組織用于形態(tài)學檢測。

1.4 石蠟切片Masson和TUNEL染色

Masson染色：心臟組織甲醛固定48h后，流水沖洗4 h，進行常規(guī)石蠟包埋和切片操作，嚴格按照Masson染色試劑盒操作說明進行心臟Masson染色。光學顯微鏡觀察并拍照，Image Pro Plus軟件統(tǒng)計膠原容積百分比（collagen volume fraction%，CVF%）。

TUNEL檢測：嚴格按照TUNEL凋亡檢測試劑盒操作說明進行。5 μm石蠟切片脫蠟脫水，滴加蛋白酶K置于濕盒中，37℃孵育30 min，PBS清洗5 min×5次，于濕盒中37℃避光孵育TUNEL檢測液1 h，PBS清洗5 min×5次，封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察陽性顆粒。

1.5 HUVEC和H9C2細胞培養(yǎng)及分組

細胞培養(yǎng)方法：采用10%FBS DMEM培養(yǎng)基于37℃CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)大鼠心肌細胞（H9C2），采用不含外泌體的細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)人臍靜脈內皮細胞（human um‐bilical vein endothelial cells，HUVEC）。在干預細胞前統(tǒng)一更換為不含牛血清及外泌體的培養(yǎng)基，使用AMPK激動劑（acadesine，AICAR）模擬細胞水平運動效應，脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）誘導細胞損傷模型。

細胞干預分組：使用無外泌體培養(yǎng)基培養(yǎng)HUVEC細胞，提取外泌體；使用外泌體（exo）、AMPK激動劑（AICAR，2 mmol/L，24 h）、脂多糖（LPS，10 μg/mL，4 h）干預H9C2細胞，將H9C2細胞分為正常組（H9C2），＋LPS＋exo組，＋AICAR＋LPS＋exo組。

1.6 外泌體提取及鑒定

100 mm培養(yǎng)皿培養(yǎng)HUVEC細胞，在HUVEC細胞長至對數(shù)生長期時更換為無外泌體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后收集細胞培養(yǎng)基。按照外泌體提取試劑盒抽提外泌體。提取后的外泌體分別進行納米顆粒示蹤分析（Nanoparti‐cle Tracking Analysis，NTA）鑒定和Western Blotting檢測。

取20 μL外泌體并按體積比例加入5×loading buffer后100℃變性，Western Blotting檢測外泌體標志蛋白CD9、CD81、TSG101，連續(xù)上樣3次排除誤差。粒徑結果和Western Blotting結果顯示，抽提到的外泌體分布在100～150 nm，且外泌體marker鑒定結果為陽性，表明HUVEC細胞可分泌產生外泌體（圖1）。

1.7 外泌體內吞實驗

使用PHK26紅色熒光孵育外泌體，將外泌體按照等量體積（96孔板每孔加30 μL外泌體，6孔板每孔加100 μL外泌體）加入H9C2細胞孵育培養(yǎng)24 h，檢測H9C2細胞對外泌體的吞運情況。

1.8 培養(yǎng)細胞TNUEL檢測

嚴格按照TUNEL檢測試劑盒操作。收集細胞，PBS洗1次，4%多聚甲醛固定細胞30 min后，制備細胞涂片。0.3%PBS稀釋的Triton X-100室溫孵育樣品5 min，PBS洗3次×5 min/次。在樣品上加50 μL TUNEL檢測液，37℃避光孵育60 min，PBS洗3次×5 min/次，封片。熒光顯微鏡下觀察TUNEL陽性顆粒。

圖1 外泌體NTA及Western Blotting鑒定結果Figure 1.NTA and Western Blotting Identification of Exosomes

1.9 培養(yǎng)細胞Hoechst 33342染色

使用標準6孔板培養(yǎng)H9C2細胞，待條件培養(yǎng)完成后更換為無血清培養(yǎng)基，將濃度為100×的Hoechst 33342活細胞染色液稀釋為1×，1 mL培養(yǎng)基添加10 μL Hoechst 33342染色液，37℃孵育30～60 min后PBS洗3次。熒光顯微鏡下觀察，細胞核高亮、皺縮則判斷為凋亡細胞陽性。

1.10 蛋白提取和Western Blotting

動物蛋白提取：剪取50 mg液氮保存的心臟組織，加入300 μL提前配制的裂解液混合物，冰浴下勻漿，離心取上清進行BCA蛋白定量，后按比例加入5×loading buf‐fer，蛋白變性后用于Western Blotting檢測。

細胞蛋白提?。菏占毎鞍?，按比例加入蛋白抽提液，超聲震蕩破裂蛋白，4℃離心，取蛋白上清，進行BCA蛋白定量。

Western Blotting實驗：SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，濕轉法轉膜，室溫下5%BSA封閉1 h，4℃過夜孵育一抗。次日TBST清洗，室溫孵育二抗1 h，再次TBST清洗。滴加ECL發(fā)光液，凝膠成像系統(tǒng)發(fā)光成像。

1.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

Western Blotting結果圖片使用Image J進行灰度統(tǒng)計，Hoechst 33342核染色，TUNEL實驗計數(shù)陽性顆粒數(shù)目。使用SPSS進行單因素方差分析（one-way ANOVA），結果以平均數(shù)±標準差（M±SD）表示，選擇95%置信區(qū)間。并使用GraphPad Prism 8進行作圖。

2 實驗結果

2.1 有氧運動抑制心梗小鼠心肌細胞凋亡

小鼠心臟石蠟切片TUNEL檢測（TUNEL陽性顆粒為綠色熒光）細胞凋亡陽性顆粒數(shù)目，與S組比較，MI組細胞凋亡數(shù)目顯著增加（P＜0.05）；與MI組比較，ME組細胞凋亡數(shù)目顯著減少（P＜0.05，圖2）。

圖2 小鼠心肌TUNEL染色觀察與統(tǒng)計結果Figure 2.TUNEL Staining Results of Myocardium

提取小鼠心肌蛋白，Western Blotting檢測凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2和 cleaved-Caspase3，與 S組比較，MI組 Bax/Bcl-2比值和cleaved-Caspase3蛋白表達顯著升高（P＜0.05）；與MI組比較，ME組Bax/Bcl-2比值和cleaved-Caspase3蛋白表達顯著降低（P＜0.05），表明心梗誘發(fā)小鼠心肌細胞凋亡，有氧運動顯著抑制心梗后心肌細胞凋亡（圖3）。

圖3 小鼠心肌Bax、Bcl-2和cleaved-Caspase3蛋白表達結果Figure 3.Expression of Apoptotic Proteins Bax，Bcl-2 and cleaved-Caspase3 in Myocardium

2.2 有氧運動降低心梗心肌纖維化并改善心功能

小鼠超聲心動圖（圖4）結果顯示，與S組比較，MI組LVIDd和LVIDs顯著增加（P＜0.01），EF和FS顯著降低（P＜0.01）；與MI組比較，ME組LVIDd和LVIDs顯著降低（P＜0.01），EF和FS顯著增加（P＜0.01），表明有氧運動顯著改善心梗小鼠心功能。

圖4 小鼠心動超聲圖及心功能指標檢測結果Figure 4.Echocardiography and Cardiac Function Test Results in Mice

心肌Masson染色觀察顯示，心肌膠原纖維呈藍色，心肌纖維呈紅色。與S組比較，MI組顯著增加（P＜0.05）；與MI組比較，ME組顯著降低（P＜0.05，圖5），表明有氧運動顯著降低心梗心肌CVF%，減緩心梗心肌纖維化。

圖5 心梗小鼠心臟Masson染色結果Figure 5.Masson Staining Results in the Heart of Myocardial Infarction Mice

2.3 運動促進H9C2細胞吞運HUVEC細胞來源的外泌體

使用AICAR和LPS干預H9C2細胞，并使用HUVEC細胞分泌的外泌體孵育H9C2細胞，PKH26（紅色熒光）標記外泌體，α-Actinin（綠色熒光）標記H9C2細胞。結果顯示，正常組（H9C2組）無外泌體，與單純LPS誘導的H9C2凋亡組比較，AICAR干預24 h顯著促進H9C2對外泌體的吞運（圖6），表明運動干預促進H9C2細胞對HUVEC細胞來源的外泌體的內吞。

圖6 外泌體內吞免疫熒光實驗結果Figure 6.Results of Immunofluorescence Experiment of Exocytosis

2.4 運動促進心肌細胞吞運外泌體抑制LPS誘導的H9C2細胞凋亡

使用Hoechst33342細胞核固縮染色和TUNEL標記凋亡細胞，核固縮染色中凋亡細胞核呈緊密、固縮、高亮的藍色熒光，TUNEL標記中紅色熒光為凋亡陽性細胞。結果顯示，使用外泌體孵育細胞后，與單純LPS誘導的H9C2凋亡組比較，AICAR干預后顯著抑制H9C2細胞凋亡（P＜0.05，圖7），表明AICAR干預促進H9C2細胞內吞外泌體，顯著抑制心肌細胞凋亡。

圖7 Hoechst 33342染色及TUNEL檢測H9C2細胞凋亡實驗結果Figure 7.Hoechst 33342 Staining and TUNEL Detection of H9C2 Apoptosis

Western Blotting檢測凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2和cleaved-Caspase3，與單純LPS誘導的H9C2凋亡組比較，AIACR干預后Bax/Bcl-2比值和cleaved-Caspase3蛋白表達顯著降低（P＜0.05），表明同樣使用外泌體孵育細胞后，AICAR干預顯著抑制H9C2細胞凋亡（圖8）。

圖8 H9C2細胞凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2和cleaved-Caspase3蛋白表達結果Figure 8.Expression of Apoptotic Proteins Bax，Bcl-2 and cleaved-Caspase3 in H9C2 Cell

3 討論

外泌體由機體的多種組織細胞分泌產生，廣泛存在于動物血液、汗液和尿液等體液中。作為細胞間信息傳遞的新途徑，外泌體在心血管、免疫和腫瘤等諸多疾病中均發(fā)揮作用，因此備受關注（Grigorian-Shamagian et al.，2017；Hervera et al.，2018；Riazifar et al.，2019；Ricklefs et al.，2018）。外泌體作為載體可攜帶的miRNAs，DNA，蛋白質等生物信息物質，在機體不同生理、病理環(huán)境下會產生不同變化（Goetzl et al.，2017）。運動后機體汗液、循環(huán)血量、尿液等會發(fā)生適應性變化，如分泌汗液增加、循環(huán)血量增加等，這些體液隨著運動產生變化，而外泌體大量存在于其中，因此外泌體很大程度受運動調節(jié)。有研究將外泌體作為載體，向豬模型心梗心臟特異性注射外泌體，使其作為“補丁”改善心功能，證實外泌體具有修復心梗心臟的功能（Gao et al.，2018）。然而，運動能否通過調節(jié)外泌體的內吞效率，在心梗心臟的預防或康復中發(fā)揮作用，仍有待深入研究。因此，本研究以運動對機體細胞外泌體內吞效率的影響為研究思路，旨在探討運動對外泌體內吞的影響及其對外泌體抑制心肌細胞凋亡的調節(jié)作用。

心肌細胞可通過血液循環(huán)實現(xiàn)與血管內皮細胞的交叉對話（Kivela et al.，2019），血管內皮細胞對心肌細胞的保護作用受運動調節(jié)。運動訓練刺激內皮細胞釋放包括激素、蛋白和microRNA等組分，參與心肌細胞的保護（De Keulenaer et al.，2017）。然而，鮮見關于內皮細胞釋放的外泌體能否被心肌細胞內吞的報道。因此，本研究提取HUVEC內皮細胞分泌產生的外泌體干預H9C2心肌細胞，觀察內皮細胞釋放的外泌體在心肌細胞中的內吞效果。熒光染色結果顯示，標記外泌體的PKH26（紅色熒光）與心肌細胞骨架蛋白α-Actinin（綠色熒光）發(fā)生共定位（圖6），證實心肌細胞能夠內吞內皮細胞釋放的外泌體。目前鮮見研究探討運動對外泌體內吞效率的影響，為此本研究采用AICAR模擬運動刺激（Narkar et al.，2008），發(fā)現(xiàn)與LPS＋exo組比較，LPS＋exo＋AICAR組外泌體內吞數(shù)量顯著增加（圖6），表明模擬運動干預增加心肌細胞對外泌體的內吞效率。上述結果提示，運動可能通過促進心肌細胞內吞內皮細胞釋放的外泌體，提高心肌細胞外泌體的內吞效率。

細胞凋亡是在生物體中發(fā)生的程序性細胞死亡的一種形式，是生化事件導致細胞特征性變化和死亡，這些變化包括細胞皺縮、核破裂、染色質濃縮和染色體DNA片段化等（Fritsch et al.，2019；Newton et al.，2019）。適度細胞凋亡對于生物體的穩(wěn)態(tài)至關重要，但過度凋亡則促進多種心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展（Zhang et al.，2018a）。心肌細胞凋亡受各種應激因素誘導，如某些細胞因子、氧化應激、DNA損傷和鐵依賴型死亡等。因此，抑制心肌細胞凋亡是心梗心臟康復的重要靶點之一。外泌體作為體內多種生物活性物質的載體，通過運輸傳遞各類生物信息的方式，在多種組織器官中參與調控細胞凋亡的發(fā)展進程。骨組織相關研究發(fā)現(xiàn)，間充質干細胞分泌的外泌體通過運載miR-21至髓核細胞，調節(jié)免疫反應和細胞凋亡（Cheng et al.，2018；Zhang et al.，2018b）。在胸腺癌細胞中外泌體介導的lncRNA轉運進入癌細胞后，促進癌細胞的凋亡進程（Wang et al.，2018）。心肌細胞研究發(fā)現(xiàn)，運動促進miR-342-5p分泌并通過外泌體途徑靶向缺血性心臟的心肌細胞，通過抑制心肌細胞凋亡改善缺血心臟心功能，且主動脈內皮細胞是運動后循環(huán)系統(tǒng)外泌體miR-342-5p增加的主要來源（Hou et al.，2019）。在此基礎上，本研究通過檢測凋亡相關指標發(fā)現(xiàn)，與外泌體單獨干預比較，外泌體和AICAR合并干預后TUNEL陽性顆粒數(shù)目、Bax/Bcl-2比值和cleaved-Caspase3顯著降低（圖7～圖8），表明外泌體和模擬運動協(xié)同干預抑制細胞凋亡的效果顯著優(yōu)于外泌體單獨干預。同時，在體研究表明，運動抑制心梗心肌細胞凋亡，改善心功能。提示，運動可能通過促進細胞外泌體吞運方式，發(fā)揮抑制細胞凋亡的作用，也表明運動在外泌體運輸過程中可能發(fā)揮重要作用（圖9）。

圖9 運動可能通過促進心肌細胞外泌體內吞抑制心肌細胞凋亡Figure 9.Exercise Inhibits Myocardial Apoptosis by Promoting Exocytosis of Myocardial Cells

運動效應可能通過改變細胞對外泌體的內吞效率進而對細胞凋亡產生影響，直接提取運動干預后的外泌體進行動物注射干預和體外細胞培養(yǎng)，檢測外泌體內吞變化，對細胞外泌體內吞過程進行高分辨率實時動態(tài)追蹤檢測，能更加全面反映運動對外泌體運輸過程的影響，這有待進一步深入研究。

4 結論

有氧運動顯著抑制心梗心肌細胞凋亡，改善心功能；HUVEC內皮細胞可分泌產生外泌體，且AMPK激動劑AICAR顯著促進H9C2心肌細胞對HUVEC細胞來源的外泌體內吞，抑制H9C2心肌細胞凋亡。推測，運動可能通過促進心肌細胞外泌體內吞，抑制心肌細胞凋亡，改善心梗心功能。