上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米技術(shù)檢測(cè)食品中磺胺類藥物含量

桂麗娟，梁紫璐，羅永文，莊健樂，畢水蓮

（1.廣東藥科大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，廣東中山 528458）（2.廣東藥科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東廣州 510006）（3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510642）（4.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)材料與能源學(xué)院，廣東廣州 510642）

磺胺類藥物（Sulfonamides，SAs）是一種具有對(duì)氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的人工合成抗菌藥物，SAs由于對(duì)氨基苯磺?；系腞基能夠被不同的雜環(huán)所取代，可形成含五元雜環(huán)的SAs和含六元雜環(huán)的SAs[1]。SAs抗菌譜廣，對(duì)多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌、陰性球菌及某些革蘭氏陰性桿菌均有抑制作用[2]。SAs因抗菌廣、成本低而被廣泛用于畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)以防治疾病和促進(jìn)生長(zhǎng)[3,4]，隨著抗生素的廣泛和過度使用，導(dǎo)致動(dòng)物性食品中SAs的殘留十分嚴(yán)重，人類通過長(zhǎng)期攝入這些動(dòng)物性食品會(huì)引起過敏、抗生素耐藥性、菌群紊亂甚至細(xì)胞癌變等問題[5-7]。而我國(guó)農(nóng)業(yè)部規(guī)定動(dòng)物性食品中磺胺類藥物的殘留限量不能超過100 μg/kg[8]。

SAs的檢測(cè)方法常見的有微生物檢測(cè)法[9,10]、免疫檢測(cè)法[11,12]、毛細(xì)管電泳[13,14]、高效液相色譜法[15,16]和液相色譜-質(zhì)譜法等[17,18]。微生物檢測(cè)法是通過抗生素藥物對(duì)微生物抑制作用來(lái)測(cè)定抗生素藥物殘留量的方法，該方法價(jià)格低廉、簡(jiǎn)單，但操作過程繁瑣且易受主觀因素影響導(dǎo)致結(jié)果不夠準(zhǔn)確。免疫學(xué)分析法操作簡(jiǎn)單，適用范圍廣；而高效液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜等方法雖然靈敏度和特異度較高，但這些方法均存在成本高、對(duì)操作人員要求高以及樣品前處理過程復(fù)雜等問題[19]，不利于快速檢測(cè)目標(biāo)物，因此，有必要建立一種快速檢測(cè)食品中殘留SAs的有效方法。

上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料（Upconverting nanoparticles，UCNPs）是一種在近紅外光激發(fā)下能發(fā)出可見光的發(fā)光材料，即能夠?qū)⒔t外長(zhǎng)波長(zhǎng)的激發(fā)光轉(zhuǎn)換為短波長(zhǎng)的紫外或可見光[20,21]。該類材料不僅具有低毒性、高抗光漂白性、沒有生物樣品背景熒光干擾等優(yōu)點(diǎn)，還具有很大的反斯托克斯效應(yīng)和較強(qiáng)的細(xì)胞組織穿透力[22,23]，因此成為了很多上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米技術(shù)（Upconversion fluorescence nanotechnology，UPNT）中理想的熒光供體，在生物成像、生物傳感、生物檢測(cè)、光動(dòng)力治療和食品安全等方面被廣泛運(yùn)用[24-27]。而大多數(shù)應(yīng)用于生物檢測(cè)領(lǐng)域的上轉(zhuǎn)換納米材料都是基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET），F(xiàn)RET是一種通過分子間偶極-偶極耦合從被激發(fā)的供體熒光團(tuán)轉(zhuǎn)移到受體熒光團(tuán)的能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象[28]。為了提高FRET的效率和靈敏度，合適的能量供體與受體顯得尤為重要，UCNPs因其獨(dú)特的光學(xué)特性常被用作能量供體[29,30]，而金納米顆粒（Gold nanoparticles，GNPs）因具有良好的熒光淬滅能力被廣泛用作能量受體[31]?；?UCNPs所構(gòu)建的FRET體系已被用于檢測(cè)各種目標(biāo)物[32-34]。Hu等[29]人利用與抗體相結(jié)合的上轉(zhuǎn)換納米粒子NaYF4：Yb/Tm和被抗原包被的單分散磁性聚苯乙烯微球（MMPMs）建立了一種用于檢測(cè)食品中磺胺喹喔啉的熒光免疫測(cè)定法，得到檢測(cè)限0.5 μg/kg。隨后該研究團(tuán)隊(duì)基于 UCNPs或量子點(diǎn)和包被抗原的膠體金納米建立了熒光猝滅免疫色譜條用于檢測(cè)磺胺類藥物，其中磺胺喹喔啉和磺胺甲惡唑的檢測(cè)限分別為 1 ng/mL和5 ng/mL[35]，雖然該方法成本低，易于判斷，但通過目測(cè)色譜帶的變化易受主觀因素的影響，且靈敏度和特異度有待提高。因此，本文基于上轉(zhuǎn)換納米粒子NaYF4:Yb,Er和GNPs來(lái)構(gòu)建更為靈敏、穩(wěn)定的檢測(cè)食品中含五元雜環(huán)磺胺類藥物的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

稀土氧化物（氧化釔，氧化鐿，氧化鉺，99.99%）、硝酸（HNO3）、氟化鈉（NaF）、檸檬酸鈉、氫氧化鈉（NaOH）、正硅酸乙酯（TEOS）、3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）、氨水（NH3·H2O，25%）均為分析純，購(gòu)買于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氯金酸（HAuCl4，Au≥47.5%）、PVP（平均分子量58000）、戊二醛（25%，AR），硼氫化鈉（NaBH4，GR）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、甲氧芐氨嘧啶（Trimethoprim，TMP）、磺胺甲惡唑（Sulfamethoxazole，SMZ）、乙醇（分析純），均購(gòu)買于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；磺胺類抗原（SAs Ag-BSA，-20 ℃保存）、含五元雜環(huán)磺胺類藥物抗體（SAs-Ab，-20 ℃保存）、牛血清白蛋白（BSA，4 ℃保存），購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司；磷酸緩沖溶液（0.01 mol/L PBS，實(shí)驗(yàn)室自制）；牛奶（伊利牛奶，500 mL）；實(shí)驗(yàn)中用水均為超純水。

1.2 主要儀器和設(shè)備

Nicolet iS5傅立葉變換紅外光譜儀、低溫高速離心機(jī)和溴化鉀壓片，均購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher公司；XD-2X/M4600型號(hào)X射線衍射儀，北京普析通用儀器有限公司；JEM-2100F型號(hào)透射電子顯微鏡，日本電子株式會(huì)社；UV-1800紫外分光光度計(jì)，日本Shimadzu公司；Nova Nano SEM 430場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡，荷蘭FEI公司；KQ-2200DB型超聲波清洗器，反應(yīng)釜，均相反應(yīng)器和磁力加熱攪拌器，均購(gòu)自鄭州鞏義儀器設(shè)備公司；pH計(jì)，上海雷磁儀器廠；配備有R928光電倍增管探測(cè)器的JOBIN YVON TRIAX 320光譜儀，法國(guó)HORIBA Jobin Yvon公司；976 nm激光二極管，美國(guó)Coherent Corp公司。

1.3 方法

1.3.1 上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料NaYF4:Yb,Er的制備及修飾[36,37]

通過水熱法制備 NaYF4:Yb,Er，具體步驟如下：稱取一定量的稀土氧化物氧化釔、氧化鐿和氧化鉺分別放入不同的燒瓶中，然后向燒瓶中滴加HNO3溶液直到氧化物溶解，通過加熱蒸發(fā)去除多余的HNO3溶液，最后加入去離子水即可配成稀土硝酸溶液。然后分別取2.5 mL硝酸釔溶液，1.5 mL硝酸鐿和1.2 mL硝酸鉺溶液，混合均勻；再取2 mL的檸檬酸鈉溶液和25 mL NaF溶液，在磁力攪拌下緩慢滴加到上述混合溶液中，然后將混合溶液轉(zhuǎn)移到高壓反應(yīng)釜中，用NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值（pH=5），磁力攪拌1 h。攪拌完后將反應(yīng)釜放入烘箱干燥，180 ℃加熱4 h，然后使反應(yīng)釜冷卻至室溫，將得到的沉淀物轉(zhuǎn)移到離心管中進(jìn)行離心，離心后棄上清液并用二次蒸餾水、乙醇清洗3次，最后收集洗滌好的沉淀于60 ℃烘箱中烘干24 h，即可獲得上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料（NaYF4:Yb,Er），研磨成粉末備用。

為使合成的上轉(zhuǎn)換納米材料具備良好的生物相容性，需對(duì)其進(jìn)行表面修飾。采用改良的 St?ber法[38]對(duì)其進(jìn)行修飾，取制備好的NaYF4:Yb,Er粉末40 mg溶于60 mL正丙醇溶液中，攪拌均勻后將混合溶液放入恒溫水浴鍋中35 ℃下攪拌40 min，然后分別量取20 mL純水和2.5 mL 25%的氨水加入上述混合溶液中，反應(yīng)1 h。取25 μL正硅酸乙酯并將其溶于20 mL的正丙醇溶液中，然后將其逐滴滴加至上述溶液，繼續(xù)反應(yīng)4 h。為了表面修飾上氨基，將0.2 mL的APTES溶液溶于30 mL的正丙醇溶液，并滴入到上述溶液中，劇烈攪拌1 h，接著將反應(yīng)后的溶液轉(zhuǎn)移至離心管中離心，離心后棄上清，得到的沉淀物用乙醇和蒸餾水洗滌3次。最后將其放入60 ℃烘箱中烘干12 h，即可獲得氨基化的上轉(zhuǎn)換納米粒子NaYF4:Yb,ErUCNPs。

1.3.2 UCNPs連接抗磺胺類抗體的制備

參照文獻(xiàn)[39]，采用經(jīng)典的戊二醛交聯(lián)法稍作修飾進(jìn)行制備，具體為：取制備好的氨基化上轉(zhuǎn)換納米粒子粉末20 mg，利用超聲將其分散在5 mL PBS溶液中，然后加入 1.25 mL 25%戊二醛溶液和 100 mg NaBH4，混合后在室溫下振蕩1 h。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行離心，得到的沉淀用PBS洗滌3次，洗滌完后將沉淀物再次超聲分散在 PBS中，然后將25 μL SAs-Ab和100 mg NaBH4加入上述溶液，在室溫?fù)u床上振搖1 h。最后，加入100 mg Tris作為封閉劑，室溫下緩慢振搖1 h。反應(yīng)結(jié)束后通過離心得到沉淀物，用PBS洗滌3次后去掉上清液并用1 mL PBS收集沉淀，得到的SAs Ab-NaYF4:Yb, ErUCNPs于4 ℃下保存。

1.3.3 金納米材料（Gold nanoparticles，GNPs）制備及偶聯(lián)磺胺類抗原

GNPs是通過利用檸檬酸鈉作為還原劑進(jìn)行制備[40,41]，具體為：先用0.0216 g HAuCl4和240 mL去離子水混合以制備 HAuCl4水溶液，然后將溶液轉(zhuǎn)移到三頸圓底燒瓶中，劇烈攪拌下升溫到100 ℃，保持10 min。然后取檸檬酸鈉0.125 g溶解于12.5 mL去離子水中制備成檸檬酸鈉水溶液，接著迅速將檸檬酸鈉溶液加入到上述溶液中，溶液顏色由黃色變成酒紅色后，保持反應(yīng)30 min，自然冷卻到室溫后加入1 mL去離子水和0.0042 g PVP，混合后室溫下攪拌過夜，即可得到的GNPs溶液。

取上述制備好的GNPs 10 mL，用PBS將溶液的pH值調(diào)至8，然后往溶液中加入20 μL SAs Ag-BSA，冰浴中攪拌1 h。接著加入50 mg BSA作為封閉劑，繼續(xù)攪拌1 h。反應(yīng)后將溶液在10000 r/min下離心10 min，得到沉淀用0.01 mol/L PBS洗滌3次，棄上清液，最后分散在10 mL 0.01 mol/L PBS中，得到GNPs偶聯(lián)SAs Ag BSA的溶液，即SAs Ag BSA-GNPs。

為使 SAs Ag BSA-GNPs能夠很好的與 SAs Ab-NaYF4:Yb, ErUCNPs結(jié)合到一起，通過固定GNPs的量，調(diào)整磺胺類抗原的含量，使其添加量由20 μL增加到60 μL，以得到最合適的SAs Ag BSA-GNPs含量。

1.3.4 構(gòu)建UCNPs-GNPs體系，檢測(cè)不同含量的SAs

將含有 100 μL 25 μg/mL SAs Ab-NaYF4:Yb,ErUCNPs溶液分別添加到一系列含有SAs Ag-BSA溶液的小試管中，反應(yīng)0.5 h后取制備好的20 μg /mL SAs Ag-BSA-GNPs溶液適量加入上述小試管中，然后加入PBS溶液定容至1 mL，室溫下振搖40 min，用光譜儀進(jìn)行熒光測(cè)定。

1.3.5 檢測(cè)牛奶中含五元雜環(huán)SAs

將相同濃度的SAs Ag-BSA、BSA、抗生素SMZ和 TMP分別加入到牛奶中，形成混合溶液。然后將等量的牛奶混合溶液分別加入到含有 100 μL 25 μg/mL的SAs Ab-NaYF4:Yb，ErUCNPs溶液的若干小試管中，反應(yīng) 0.5 h，接著將適量 20 μg/mL SAs Ag-BSA-GNPs溶液加入上述混合溶液中，并用 PBS溶液將溶液定容至 1 mL，同時(shí)使混合物濃度調(diào)整為20 ng/mL，置于搖床上反應(yīng)40 min后，進(jìn)行熒光測(cè)定。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

利用掃描電子顯微鏡（Scanning electron microscope，SEM）和X射線衍射（X-ray diffraction，XDR）分別對(duì)NaYF4:Yb,Er UCNPs的形貌和晶型結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征；對(duì)NaYF4:Yb,Er UCNPs修飾前后的表征通過傅立葉變換紅外光譜儀（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）；利用透射電子顯微鏡（Transmission electron microscope，TEM）和紫外吸收光譜（Ultraviolet visible spectroscopy，UV-vis）檢測(cè)合成的GNPs以及偶聯(lián)磺胺類抗原的金納米顆粒。在976 nm激發(fā)光下對(duì)偶聯(lián)了磺胺類抗體 NaYF4:Yb,Er UCNPs進(jìn)行熒光測(cè)試，觀察其是否成功連接上抗體。

2 結(jié)果與討論

2.1 UCNPs-GNPs體系的原理

UCNPs-GNPs體系的原理實(shí)際上是熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）的過程，F(xiàn)RET是一種通過分子間偶極-偶極耦合從被激發(fā)的供體熒光團(tuán)轉(zhuǎn)移到受體熒光團(tuán)的非輻射能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象[28]。其作用機(jī)理如圖 1所示，通過將NaYF4:Yb,Er UCNPs作為能量供體，GNPs作為能量受體，分別結(jié)合SAs抗體和抗原，由于能量供體的發(fā)射光譜與能量受體的吸收光譜能夠發(fā)生重疊，抗原抗體會(huì)發(fā)生特異性結(jié)合，因此能夠縮短供受體分子之間的間距，使二者足夠靠近，從而實(shí)現(xiàn)能量淬滅。通過添加一定量的游離抗原，讓其和GNPs上的抗原發(fā)生免疫競(jìng)爭(zhēng)，從而破壞UCNPs和GNPs的FRET體系，使熒光量得以恢復(fù)，因此可根據(jù)熒光強(qiáng)度的變化對(duì)游離的抗原進(jìn)行量化。而實(shí)現(xiàn)FRET主要需滿足以下2個(gè)條件：（1）供體的發(fā)射光譜和受體的吸收光譜要有重疊；（2）供體必須足夠靠近受體，二者之間的間距要足夠小[42]。

圖1 NaYF4:Yb,Er UCNPs和GNPs的FRET過程Fig.1 The FRET Process Between NaYF4:Yb,Er UCNPs and GNPs

2.2 UCNPs和GNPs的合成表征

圖2 (a)NaYF4:Yb,Er UCNPs的SEM圖；(b)GNPs的TEM圖；(c)NaYF4:Yb,Er UCNPs的XRD圖；(d)NaYF4:Yb,Er UCNPs修飾前后的紅外譜圖Fig.2 (a) The SEM image of NaYF4:Yb,Er UCNPs; (b) the TEM image of GNPs; (c) The XRD patterns of NaYF4:Yb,Er UCNPs; (d) The image of FT-IR spectrum of the NaYF4:Yb,Er UCNPs before and after surface modification(amino-NaYF4:Yb,Er UCNPs)

利用掃描電子顯微鏡（SEM）對(duì) NaYF4:Yb,Er UCNPs的形貌進(jìn)行表征，圖2a為NaYF4:Yb,Er UCNPs的 SEM 圖。從圖中可看出通過水熱法制備的NaYF4:Yb,Er UCNPs粒徑均一，約為80 nm。由于合成的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料表面沒有羧基或氨基等親水性的官能團(tuán)，不能與生物大分子材料相結(jié)合，因此需對(duì)其表面進(jìn)行氨基化修飾[43]。利用X射線衍射（XDR）對(duì)NaYF4:Yb,Er UCNPs晶型結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，結(jié)果如圖2c所示。從圖 2c中可看出，采用二氧化硅殼包被并用TEOS和 APTES進(jìn)一步功能化修飾 NaYF4:Yb,Er UCNPs后，所得的氨基功能化NaYF4:Yb,Er UCNPs與標(biāo)準(zhǔn)卡片JCPDS No.16-334一致，且沒有明顯的雜質(zhì)峰，這表明NaYF4:Yb,Er UCNPs具有純正六方相晶型，同時(shí)氨基化修飾后與修飾前相比，上轉(zhuǎn)換納米材料的結(jié)構(gòu)沒有受到影響，修飾后的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，這為后續(xù)構(gòu)建FRET體系提供了良好的基礎(chǔ)。圖2d為NaYF4:Yb,Er UCNPs修飾前后的紅外圖譜（FT-IR），從FT-IR中可看出，修飾前，在3417、2928、2873 cm-1處出現(xiàn)了強(qiáng)度不一的吸收峰，其中在3417 cm-1觀察到羥基的伸縮振動(dòng)特征峰；2928和2873cm-1等處出現(xiàn)了屬于亞甲基的不對(duì)稱和對(duì)稱伸縮振動(dòng)特征峰。氨基修飾后，出現(xiàn)了一個(gè)位于1084 cm-1處新的吸收峰，同時(shí)伴隨2928、2873cm-1處的吸收峰消失，這歸結(jié)于二氧化硅鍵的對(duì)稱伸縮振動(dòng)，說(shuō)明上轉(zhuǎn)換納米材料已成功被二氧化硅包覆。而在3251和1612 cm-1處均出現(xiàn)了由氨基引起的振動(dòng)峰，這也證明了所制備的NaYF4:Yb,Er UCNPs氨基化修飾成功。

用透射電鏡（TEM）對(duì)GNPs的合成進(jìn)行表征，結(jié)果如圖2b所示。通過檸檬酸鈉合成法制備的GNPs表面帶有負(fù)電荷，形狀近似為球形，尺寸相對(duì)均勻，為10 nm，具有良好的分散性[38]

2.3 NaYF4:Yb,Er UCNPs連接SAs Ab和GNPs連接SAs Ag-BSA的表征

圖3 976 nm激發(fā)下NaYF4:Yb,Er UCNPs熒光圖譜和GNPs的紫外吸收光譜Fig.3 Fluorescence spectra of NaYF4:Yb, Er UCNPs in the 976 nm excitation and the UV absorption spectra of GNPs

上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料在976 nm激發(fā)光下發(fā)射出綠光，如圖3所示。從圖中可看出NaYF4:Yb,ErUCNPs具有三個(gè)熒光特征發(fā)射峰，分別位于525 nm，541 nm和660 nm處，這是由于離子與離子之間發(fā)生能級(jí)躍遷所致。其中541 nm處的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，呈現(xiàn)出明顯的綠色熒光，故將其作為響應(yīng)光譜，后續(xù)平臺(tái)的構(gòu)建主要看此處的熒光強(qiáng)度變化。此外，通過對(duì)UCNPs和SAs-Ab偶聯(lián)前后的熒光圖進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)偶聯(lián)后的波長(zhǎng)和形狀與偶聯(lián)前相一致，發(fā)射峰的位置沒有改變，但位于541 nm處熒光強(qiáng)度有所減弱，說(shuō)明UCNPs已經(jīng)成功連接上抗體。

圖4 不同SAs Ag-BSA 含量結(jié)合GNPs的可見吸收光譜圖Fig.4 The visible absorption spectrum of different SAs Ag-BSA amout binding with GNPs

圖5 SAs Ag-BSA GNPs的紫外-可見吸收光譜和SAs Ab-NaYF4:Yb,Er UCNPs的熒光發(fā)射光譜圖Fig.5 The fluorescence recovery UV-vis absorption spectrum of SAs Ag-BSA GNPs and the UC fluorescence emission spectrum of SAs Ab-NaYF4:Yb,Er UCNPs

圖4為不同含量的SAs Ag-BSA與GNPs結(jié)合后可見吸收光譜圖，可看出GNPs的紫外可見吸收光譜由偶聯(lián)前的520 nm紅移到偶聯(lián)后的525 nm處，這種紅移現(xiàn)象與YOU等[40]人的研究相似，說(shuō)明GNPs已成功偶聯(lián)上了SAsAg-BSA，在紅移的過程中沒有明顯的峰展寬，說(shuō)明GNPs不僅沒有聚集現(xiàn)象而且具有良好的分散性，同時(shí)，偶聯(lián)SAs Ag-BSA后的GNPs所產(chǎn)生的紅外的吸收光譜紅移后有利于提高FRET體系的靈敏度[44]。從圖中也可看出，隨著SAs Ag-BSA的增加，吸收峰位置發(fā)生了變化，其位置變?yōu)?528 nm處。當(dāng)抗原濃度增加到40 μL和60 μL時(shí)，吸收峰位置不再隨之改變，可見當(dāng)抗原濃度為20 μL時(shí)是最適宜濃度。當(dāng)UCNPs和GNPs結(jié)合后引起能量共振轉(zhuǎn)移時(shí)，GNPs的吸收光譜和UCNPs的熒光發(fā)射光譜具有重疊的光譜（如圖5所示），能夠發(fā)生熒光淬滅，說(shuō)明UCNPs與GNPs之間存在靜電吸引，能很好的結(jié)合到一起。

2.4 基于 UCNPs-GNPs體系檢測(cè)磺胺類藥物的結(jié)果

圖6 (a)不同濃度的SAs Ag-BSA在FRET體系的熒光強(qiáng)度；(b)不同濃度SAs Ag-BSA中FRET體系的熒光強(qiáng)度關(guān)系；(c)20 ng/mL濃度下BSA、SAs Ag-BSA、SMZ和TMP的熒光強(qiáng)度Fig.6 (a) The fluorescence spectra in the FRET system with different concentrations of SAs Ag-BSA; (b) The relationship between the different concentration of SAs Ag-BSA and the fluorescent intensity in FRET system; (c) The differential fluorescence response of the aptasensor to BSA、SAs Ag-BSA、antibiotic of SMZ and TMP at the same concentration (20 ng/mL)

為了定量檢測(cè)磺胺類藥物，改變游離抗原的加入量，檢測(cè)在976 nm的紅外光激發(fā)下的發(fā)光強(qiáng)度變化量。如圖6a所示，熒光量隨著游離抗原濃度的增加而逐漸增加。圖 6b為不同濃度 SAs Ag-BSA下UCNPs-GNPs體系的熒光強(qiáng)度關(guān)系，其中I-I0代表熒光淬滅-恢復(fù)量（I：加入不同濃度SAs Ag-BSA后的UCNPs-GNPs體系熒光量，I0：沒有加 SAs Ag-BSA的UCNPs-GNPs體系熒光量），隨著SAs Ag-BSA濃度的增加，體系中的熒光恢復(fù)量逐漸增加，直到 100 ng/mL熒光強(qiáng)度開始趨于平穩(wěn)。在0.08～100 ng/mL范圍內(nèi)抗原濃度與 UCNPs的熒光強(qiáng)度顯示出了良好的線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.99371，且當(dāng)濃度高于100 ng/mL時(shí)，UCNPs的熒光強(qiáng)度逐漸平穩(wěn)，檢測(cè)限為0.08 ng/mL，比文獻(xiàn)報(bào)道的基于NaYF4：Yb/Tm和MMPMs所構(gòu)建的檢測(cè)方法的檢測(cè)限低[29]，這說(shuō)明本文所構(gòu)建的FRET體系能夠用于磺胺類藥物的免疫測(cè)定。

2.5 牛奶中磺胺類藥物檢測(cè)結(jié)果

圖6c為20 ng/mL濃度下BSA、SAs Ag-BSA、TMP和 SMZ的熒光強(qiáng)度變化圖。如圖所示，在UCNPs-GNPs體系中，添加了牛奶的溶液的熒光強(qiáng)度比添加了PBS的熒光強(qiáng)度略有減弱，但總體上影響不大，說(shuō)明牛奶并不會(huì)改變上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料的發(fā)光性質(zhì)。而添加了BSA和TMP的混合溶液與未添加抗原的牛奶混合溶液相比，熒光強(qiáng)度基本保持一致，沒有明顯改變，說(shuō)明二者不會(huì)與體系中的SAs Ab-UCNPs發(fā)生免疫反應(yīng)，也不會(huì)和SAs Ag-BSA-GNPs形成免疫競(jìng)爭(zhēng)。而添加了SAs Ag-BSA和SMZ的溶液，熒光強(qiáng)度均增強(qiáng)，說(shuō)明二者能夠與體系中的抗體發(fā)生免疫反應(yīng)。同時(shí)，也證明所構(gòu)建的FRET體系具有良好的特異性。BSA和TMP都不含有五元雜環(huán)，不能與體系中的抗體發(fā)生反應(yīng)，而SAs Ag-BSA和SMZ都含有五元雜環(huán)，能夠與UCNPs-GNPs體系中的抗體發(fā)生特異性結(jié)合，使得UCNPs和GNPs的FRET體系破壞，熒光淬滅消失，使得熒光量得以恢復(fù)，這說(shuō)明基于UCNPs-GNPs所構(gòu)建的FRET體系可以運(yùn)用到牛奶樣品中含五元雜環(huán)磺胺類藥物的檢測(cè)。

3 結(jié)論

本研究利用 UCNPs發(fā)光性能好、低毒性、抗光漂白、對(duì)生物樣品無(wú)損傷等特點(diǎn)，結(jié)合 GNPs構(gòu)建FRET體系，為SAs檢測(cè)提供了一種快速、靈敏、穩(wěn)定的方法，能夠檢測(cè)痕量含五元雜環(huán)SAs殘留，得到最低檢測(cè)限為 0.08 ng/mL，線性相關(guān)度在 0.08～100 ng/mL之間，同時(shí)也適用于牛奶中含五元雜環(huán)SAs的檢測(cè)，為食品安全檢測(cè)提供技術(shù)支持與良好的保障，也為UPNT運(yùn)用于檢測(cè)食品中更多的有害物質(zhì)提供了新思路和良好的基礎(chǔ)。