超聲波輔助-綠色低共熔溶劑提取茉莉花黃酮的工藝優(yōu)化

都宏霞，劉宴秀,2，嚴忠杰，胡梓恒，劉高榮，吳晨雨

（1.南京科技職業(yè)學院化工與材料學院，江蘇南京 210048)（2.鹽城工學院化學化工學院，江蘇鹽城 224051）

綠色化學一直是化學領域的研究熱點，低共熔溶劑（Deep Eutectic Solvents，DESs）是繼離子液體（Ionic liquids，ILs）之后由Abbott等人2003年首次合成的一類綠色新型溶劑[1]，一般是選取2～3種綠色無毒的原料作為氫鍵受體和氫鍵供體，通過較強的分子間氫鍵作用而制得的低共熔混合物。低共熔溶劑既擁有與離子液體同樣優(yōu)秀的理化性質(zhì)，又更好地克服了離子液體合成復雜、耗能高、成本高等缺點，且具有成本低、易制備、易存放、可回收、安全無毒、生物可降解、環(huán)境友好等其他有機溶劑無法比擬的優(yōu)點，已逐漸受到廣泛關注[2,3]。目前DESs已經(jīng)逐步代替有機溶劑和離子液體應用于天然植物提取和分離方面，具有巨大潛力[4-6]。

茉莉花，屬木犀科素馨屬,花瓣如雪，花香清雅，《本草綱目》中早有記載，在我國廣泛種植，是一種藥食同源的植物，具有很高的觀賞性和實用性，深受人們喜愛。研究表明,茉莉花中含有多糖、黃酮、揮發(fā)油等多種活性成分，具有清虛火、祛寒積、治療瘡毒、祛除壞疽、腫瘤等活性功效，作為主要成分的茉莉花黃酮（flavonoids of Jasmine，F(xiàn)OJ）具有良好的抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌、調(diào)節(jié)免疫力等作用[7-11]。目前，對于黃酮類物質(zhì)的提取溶劑主要是水或甲醇、乙醇、乙酸乙酯等傳統(tǒng)的有機溶劑[12-15]，為了克服有機溶劑的污染，探索一種新型綠色、高效的茉莉花黃酮提取技術非常必要。

本文設計并制備8種DESs，首次用于茉莉花黃酮的提取，系統(tǒng)比較多種提取技術，并結(jié)合響應面法研究FOJ的最佳提取工藝，旨在提供一個更加綠色、高效、經(jīng)濟、環(huán)保的FOJ新型提取方法，更好地促進茉莉花資源的深度開發(fā)，為綠色化學的發(fā)展和中國天然產(chǎn)物的研究提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茉莉花，北京同仁堂藥店；蘆丁標準樣品，北京恒元啟天化工技術研究所；氯化膽堿，Aladdin公司；乙醇、醋酸鉀、丙二醇、1,3-丁二醇、1,2-戊二醇、蔗糖、三氯化鋁、山梨醇、甜菜堿鹽酸鹽、無水甜菜堿均為分析純。

1.2 儀器與設備

ME204E-02型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；FS-250N型超聲波提取儀，上海生析超聲儀器有限公司；7600型紫外分光光度計，上海菁華科學儀器制造有限公司；TDL-50B型低速臺式離心機，上海安亭科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 標準曲線的建立

以蘆丁作為標準對照品，通過測量其在紫外分光光度計的吸光度，建立蘆丁標準曲線，測定FOJ的含量。

準確稱取蘆丁標準品5.0 mg，用濃度為50%的乙醇定容至25.0 mL。準確稱取蘆丁標準品（0.2 mg/mL）0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于6只比色管中，分別用5.0 mL的50%乙醇，3.0 mL的0.1 M AlCl3溶液和5.0 mL的1 M醋酸鉀溶液，搖勻，同法制成空白對照：靜置反應40 min，充分接觸混合，并在波長415 nm處檢測其吸光度值。

1.3.2 DESs的制備

參考Abbott的方法[16]，設計了8組DESs（見表1），選擇氯化膽堿、無水甜菜堿和甜菜堿鹽酸鹽作為氫鍵受體，分別與不同的氫鍵供體按摩爾比 1:1，含水量50 mol，在80 ℃水浴條件下加熱攪拌，直至溶液澄清，冷卻至室溫，分別得到DES1-8備用。

1.3.3 FOJ提取量的測定

式中：Y為FOJ提取量，mg/g；c為試樣的測定質(zhì)量濃度，mg/mL；V為濾液體積，mL；D為稀釋倍數(shù)；m為原料質(zhì)量，g。

1.3.4 FOJ提取技術的比較

表2 提取技術條件表Table 2 Factors of extraction technology

精確稱取茉莉花粉 20 g，通過水提（Water Extraction，WA）、醇提（Ethanol Extraction，ET）[17,18]、低共熔溶劑提?。―eep eutectic solvents Extraction，DESs）、微波提取[19,20]、(Microwave Extraction，MA)、超聲波提?。║ltrasonic Extraction，UA）[21,22]技術來提取 FOJ，提取條件見表 2，將提取液抽濾，以轉(zhuǎn)速4000 r/min的速度進行離心10 min，將離心后溶液靜置，取上層清液，過0.45 μm濾膜，對D101大孔樹脂進行預處理后，上樣，待吸附平衡后，用去離子水、質(zhì)量濃度為30%、50%、70%、90%的乙醇溶液洗脫，每個濃度均洗脫3柱體積（BV），流速為1 BV/h，收集90%乙醇濃度的洗脫液，于45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)進行濃縮后，再用50%的乙醇溶液進行稀釋得到FOJ，根據(jù)上述方法測其吸光度，計算得出FOJ含量。

1.3.5 UA-DES-8提取FOJ的單因素實驗

1.3.5.1 摩爾比對FOJ提取量的影響

在液料比40:1，含水量50 mol，超聲時間15 min，超聲功率120 W的條件下，取甜菜堿鹽酸鹽與蔗糖的摩爾比為2:1、1:1、1:2、1:3、1:4作為變量，研究摩爾比對FOJ提取量的影響。

1.3.5.2 液料比對FOJ提取量的影響

在超聲時間15 min，超聲功率120 W，甜菜堿鹽酸鹽:蔗糖:水=1:1:50的條件下，分別取液料比40:1、60:1、80:1、100:1、120:1、140:1、160:1，研究液料比對FOJ提取量的影響。

1.3.5.3 超聲時間對FOJ提取量的影響

在超聲功率 120 W，甜菜堿鹽酸鹽:蔗糖:水=1:1:50，液料比140:1的條件下，分別取超聲時間5、10、20、30、40 min，比較超聲時間對FOJ提取量的影響。

1.3.5.4 超聲功率對FOJ提取量的影響

在超聲時間 20 min，甜菜堿鹽酸鹽:蔗糖:水=1:1:50，液料比140:1的條件下，分別取超聲功率7.5、30、60、90、120、150 W，比較超聲功率對FOJ提取量的影響。

1.3.5.5 含水量對FOJ提取量的影響

在液料比140:1，超聲時間20 min，超聲功率60 W的條件下，取甜菜堿鹽酸鹽、蔗糖與水的摩爾比為1:1:40、1:1:60、1:1:80、1:1:100、1:1:120作為變量，研究含水量對FOJ提取量的影響。

1.3.6 響應面法優(yōu)化FOJ最優(yōu)提取工藝條件

使用Design-Expert.V 8.0.6軟件中Box-Behnken組合設計來確定實驗最優(yōu)工藝[23-25]，在單因素實驗基礎上，選擇液料比、超聲功率、含水量為3因素，每個因素選擇三個對FOJ影響較大的水平，進行3因素3水平的響應面試驗，并以提取量作為響應值，各因素的三個水平分別采取-1、0、1作為編碼，如表3。

表3 響應面試驗分析因素水平表Table 3 Factors and levels of response surface methodology

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 8和Design-Expert.V 8.0.6進行數(shù)據(jù)處理、圖表制作及數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標準曲線的結(jié)果分析

經(jīng)測定分析，得回歸方程為Y=32.87X+0.14，其系數(shù)R2=0.9998，在0～0.08 mg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。

圖3中，樣品1～4、7～8與空白組中氨基酸態(tài)氮含量相近，表明在同等發(fā)酵方式發(fā)酵條件下，添加增香酵母不會對薏仁碎米醬油中氨基酸態(tài)氮的含量造成很大影響，而同時添加兩種增香酵母的樣品5、6中氨基酸態(tài)氮含量則明顯低于空白組，分析可能是總酸含量降低所致；由圖3所示，樣品7、8與樣品1～4相比，其氨基酸態(tài)氮含量相對較高，表明分別在不同發(fā)酵時期添加兩種增香酵母時氨基酸態(tài)氮含量較高，樣品7中氨基酸態(tài)氮含量高達0.872 g/100 mL，略高于樣品8，其含量與未添加增香酵母的樣品9相比增長了2.41%，因此，為提高醬油風味，樣品7是較好的添加方式。

2.2 FOJ提取技術比較分析

圖1 FOJ提取技術的比較Fig.1 Comparison of different technology for extraction of FOJ

通過WA、ET、UA、MA技術和8種DESs提取FOJ，數(shù)據(jù)表明：超聲波輔助提取效果優(yōu)于微波提取；DESs溶劑提取效果遠高于傳統(tǒng)的水提和醇提，F(xiàn)OJ提取量比水提和醇提分別提高了 3.67～4.13 mg/g和3.26～3.72 mg/g。這是因為DESs中含有大量容易與黃酮形成氫鍵的羥基和氨基，可以增加黃酮在DESs中的溶解度，同時在超聲波輔助的作用下，可以更快速的溢出，促進FOJ提取量增加。其中DES-8，即以甜菜堿鹽酸鹽和蔗糖所合成的DES效果最好，茉莉花黃酮提取量為6.38 mg/g，結(jié)果見圖1。因此，本研究以UA-DES-8為提取技術，進一步研究FOJ提取的最佳工藝條件。

2.3 單因素實驗

2.3.1 DES-8摩爾比對FOJ提取量的影響

結(jié)果如圖2所示：甜菜堿鹽酸鹽和蔗糖的摩爾比從2:1到1:4，F(xiàn)OJ提取量呈先升后降的趨勢，主要原因是DES-8體系中甜菜堿鹽酸鹽的極性相對較低，而糖基的極性相對較高，當摩爾比為1:1時，DES-8溶液的極性剛好達到最佳的效果。之后隨著蔗糖比例的增加，體系極性增加的同時粘度也隨之增加，F(xiàn)OJ在體系中，擴散速度減小，導致提取量逐漸下降。所以當甜菜堿鹽酸鹽和蔗糖的摩爾比為1:1時，F(xiàn)OJ提取量最高，為6.38 mg/g。

圖2 摩爾比對FOJ提取量的影響Fig.2 Effect of molar ration on extraction yield of FOJ

2.3.2 液料比對FOJ提取量的影響

圖3 液料比對FOJ提取量的影響Fig.3 Effect of liquid-material ratio on extraction yield of FOJ

結(jié)果如圖3所示：當液料比低于140:1時，液料比和 FOJ提取量呈正相關，提取量最高達到 13.71 mg/g；當液料比繼續(xù)增大時提取量下降，因為液料比的增加可以使體系的溶解度升高，促進茉莉花細胞破壁，使內(nèi)容物溢出率增加，但當溶解度大到一定程度時，可能會發(fā)生飽和的現(xiàn)象，導致部分黃酮無法溶解，進而影響提取效果。因此，最佳液料比為140:1。

2.3.3 超聲時間對FOJ提取量的影響

結(jié)果如圖4所示：在5～20 min時FOJ提取量呈上升趨勢，但在20～40 min時反而呈下降趨勢，這是因為時間越長，超聲波產(chǎn)生的能量就越大，在溶液中所形成的空化效應就越強，對茉莉花細胞壁的破壞程度就越強，提取量就越高。但是，隨著超聲波作用時間的延長，提取量反而降低，主要是由于隨著提取時間的增加，溫度也逐漸增加，體系同時處于超聲輻射和熱效應的作用之下，可能會產(chǎn)生雙重降解[26,27]，因此20 min之后提取量降低。結(jié)果表明最佳超聲時間是20 min，比文獻報道[8]的最優(yōu)工藝的超聲時間少 25 min，此時提取量為14.23 mg/g。

圖4 超聲時間對FOJ提取量的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction yield of FOJ

2.3.4 超聲功率對FOJ提取量的影響

圖5 超聲功率對FOJ提取量的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power on extraction yield of FOJ

結(jié)果如圖5所示：FOJ的提取量先升后降，影響趨勢與文獻報道一致[28]，在超聲功率為7.5～60 W之間一直增加，從60 W之后趨于平穩(wěn)后略有降低。因為隨著超聲波功率的增加，空化效應也更加劇烈，分子的運動速度和加速度都會增加，分子擴散就越快，超聲波對細胞壁的破碎作用越強，黃酮物質(zhì)溢出率越多。但當超聲功率大到一定程度時，會發(fā)生“飽和效應”[26]，導致提取量降低。因此最佳超聲功率為60 W，此時FOJ提取量為14.34 mg/g。

結(jié)果如圖6所示，F(xiàn)OJ的提取量隨著含水量的增加先增后降，在含水量為80 mol時達到最大，為15.13 mg/g。主要原因是水可以降低提取溶劑的粘度，并且調(diào)節(jié)極性，從而在超聲波的輔助作用下，促進溶劑的擴散，有效的提升茉莉花細胞破壁的能力，增加FOJ的提取量。而含水量增加到80 mol之后，體系的粘度開始降低，極性開始增加，會導致分子間氫鍵的斷裂、超分子結(jié)構(gòu)的丟失，最終導致提取量的下降[29,30]。

圖6 含水量對FOJ提取量的影響Fig.6 Effect of water content on extraction yield of FOJ

2.4 響應面試驗結(jié)果與優(yōu)化分析

2.4.1 響應模型的建立與分析

基于單因素試驗結(jié)果，選取液料比(A)、超聲功率(B)和含水量(C)三個主要因素為自變量，以FOJ提取量為響應值(Y)，采用 Design-expert軟件按照Box-Behnken實驗設計了15組實驗，12組為析因點實驗，3組為重復零點實驗，進行交叉設計實驗，結(jié)果見表4，方差與誤差統(tǒng)計分析見表5。

利用Design-Expert軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，得到二次多項回歸方程：

Y=15.17+0.19A+0.85B+0.30C-0.15AB+1.06AC+0.44BC-0.91A2-0.40B2-0.83C2

其中Y為提取量，A、B和C分別為對應液料比、超聲功率和含水量的編碼。由表 5的數(shù)據(jù)可知：模型的p值為0.0002，模型極顯著（p＜0.01）；失擬項p值為0.2859，結(jié)果不顯著（p＞0.05），表明擬合狀況良好。方程決定系數(shù)R2=0.9890，CV為1.41%＜10%，能真實的反映本模型，可用此模型分析響應面的變化。信噪比（Adeq Precision）為20.22大于4，表示模型合理[31]。由方差F值可知，各因素對提取量影響為：B（超聲功率）＞C（含水量）＞A（液料比）。由表5還可知，因素中B、C、AC、BC、A2、C2的影響極顯著（p＜0.01），因素A、B2的影響顯著（p＜0.05），而AB的影響不顯著，該方程可適用。

表4 響應面分析實驗設計與結(jié)果Table 4 Design and results of the response surface methodology(RSM) and box-behnken

表5 提取率響應面擬合回歸方程的方差分析結(jié)果Table 5 ANOVA results of extraction rate response surface fitting regression equation

注：*：差異顯著,p ＜0.05；**:差異極顯著，p ＜0.01；R2= 0.9890，Adj R2= 0.9693，Pre R2=0.8551。

2.4.2 響應面交互作用分析與優(yōu)化

圖7 液料比和超聲功率交互作用對提取量的影響Fig.7 Response surface of Y=f (A, B)

圖8 含水量與液料比交互作用對提取量的影響Fig.8 Response surface of Y=f (A, C)

各因素間交互作用得到響應面曲線圖。圖7～圖9分別顯示超聲功率、料液比、含水量的交互作用對FOJ提取量的影響結(jié)果。曲線走勢越陡，表明該因素影響越顯著；曲線走勢越平滑，則表明該因素影響較小[32]。圖7中，隨著超聲功率的增加，F(xiàn)OJ提取量逐漸上升，在90 W時達到最大，之后趨于平緩；圖8中，隨著液料比的增加，影響十分顯著，F(xiàn)OJ提取量呈先上升后下降的趨勢，在液料比為149:1 (mL/g)時出現(xiàn)最大值；圖9中，隨著含水量的增加，F(xiàn)OJ提取量呈現(xiàn)先升后降的趨勢，影響顯著，含水量在94 mol時達到最高點。這是因為超聲功率越大，空化效應越劇烈，分子運動速度越快，黃酮物質(zhì)溢出越多，但當超聲功率大于90 W時，發(fā)生“飽和效應”，影響黃酮溢出。而適當?shù)乃梢栽黾芋w系的黏度、調(diào)節(jié)體系極性，利于黃酮物質(zhì)溢出，但過量的水會使體系黏度變低、極性變高，導致氫鍵斷裂，使提取量降低。

圖9 含水量與超聲功率交互作用對提取量的影響Fig.9 Response surface of Y=f (B, C)

根據(jù)Design-Expert軟件得出在液料比、超聲功率和含水量交互作用影響下，最優(yōu)提取工藝為：液料比為148.91:1 (mL/g)，超聲功率為90 W，含水量為94.50 mol，在此條件下模型預測的提取率為15.90 mg/g。結(jié)合實驗室具體情況，修正提取條件為液料比 149:1(mL/g)，超聲波功率90 W，含水量94.50 mol，摩爾比1:1，超聲時間20 min，所得FOJ提取量為15.24 mg/g，與預測值相差0.66 mg/g，說明模型與實際數(shù)據(jù)擬合較好，證實所得模型的有效性，同時證實響應面對UA-DES-8提取FOJ的參數(shù)優(yōu)化具有較強的可行性和應用性。

3 結(jié)論

本文建立了一種綠色、高效、經(jīng)濟、環(huán)保的茉莉花黃酮新型提取方法。通過比對水、乙醇和8種DESs在內(nèi)的10種溶劑，以及超聲波和微波提取對FOJ提取量的影響，證實DESs的效果都優(yōu)于水和乙醇，超聲波提取的效果優(yōu)于微波，且發(fā)現(xiàn)甜菜堿鹽酸鹽作為氫鍵受體的提取效果要優(yōu)于目前普遍使用的氯化膽堿。因此，選用甜菜堿鹽酸鹽和蔗糖所構(gòu)成的DES體系。結(jié)合單因素實驗、響應面優(yōu)化實驗和實驗室條件，證實FOJ提取最佳條件是：甜菜堿鹽酸鹽：蔗糖:水=1:1:94.50，液料比149:1 (mL/g)，超聲波功率90 W，超聲時間20 min，在此條件下，F(xiàn)OJ的提取量為15.24 mg/g,與模型預測結(jié)果相差0.66 mg/g，證實模型的有效性和可行性；FOJ提取量比傳統(tǒng)的水提提高了12.99 mg/g，相當于水提的 677%，比文獻報道的通過正交優(yōu)化超聲波提取提高了7.64 mg/g，相當于其200%[8]，充分說明 UA-DESs技術可高效提取茉莉花黃酮。本文為天然植物活性成分綠色提取提供了一定的數(shù)據(jù)支撐，同時為進一步開發(fā)茉莉花資源提供了一種新思路。