雙孢蘑菇來源非特異性過氧合酶在畢赤酵母中的表達(dá)及生化表征

龐能威，楊博，王永華

（1.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510006）

（2.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）

非特異性過氧合酶（Unspecific peroxygenase，UPO，EC 1.11.2.1）屬于血紅素氧化酶超家族的一員[1]，與單加氧酶 P450的催化功能相似，它能對(duì)一系列底物進(jìn)行氧化并表現(xiàn)產(chǎn)物的出位置選擇性和立體選擇性。P450的催化反應(yīng)需要利用O2分子作為供氧劑，同時(shí)依賴 NAD(P)H輔助催化氧化過程的發(fā)生。而UPO可直接催化轉(zhuǎn)移H2O2中的氧分子到底物中，無需額外的輔因子參與，所以 UPO具有更高的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。除了催化有機(jī)化合物的非活性C-H鍵之外，UPO還可以實(shí)現(xiàn)鹵代芳香化合物的氧化[2]、含有C=C鍵化合物的環(huán)氧化[3]和硫化物的氧化[4]等，因此其在食品原料加工[5]、醫(yī)藥行業(yè)[6]和環(huán)境治理[7]等領(lǐng)域有巨大的應(yīng)用潛力。

研究發(fā)現(xiàn)，UPO主要存在于雙核菌亞界（Dikarya）和高等真菌界的子囊菌門（Ascomycota）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota）中[1]。由于真菌孢子難以實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵，從而導(dǎo)致大規(guī)模獲得野生型UPO十分困難，目前只有少數(shù) UPO被表達(dá)和鑒定。因此異源宿主重組表達(dá)是獲得 UPO重要的途徑之一，然而異源宿主重組表達(dá)具有活力的非特異性過氧合酶一直是巨大的挑戰(zhàn)[8,9]，目前報(bào)道的十余種UPO，僅有六種UPO實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)。隨著高通量基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，大量微生物基因組信息被儲(chǔ)存在公共生物數(shù)據(jù)中。利用生物信息學(xué)方法從海量數(shù)據(jù)中獲得假定的酶基因序列，是獲得有價(jià)值酶制劑的重要途徑之一。

雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）是自然界中的一種常見食用菌，它具有較強(qiáng)降解腐殖質(zhì)的能力，因此能更好地適應(yīng)復(fù)雜的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境。但是，目前尚不完全了解雙孢蘑菇利用各種養(yǎng)分資源的機(jī)制。此前Emmanuelle Morina等[10]提出假說：雙孢蘑菇可能已經(jīng)進(jìn)化出了其特有的代謝策略和生態(tài)適應(yīng)性，這都源于它具有的獨(dú)特的底物轉(zhuǎn)化酶，而 UPO正是該類物種特有的酶之一。本研究實(shí)現(xiàn)了來自Agaricus bisporus var. bisporus的非特異性過氧合酶（AbvbUPO）基因在畢赤酵母GS115進(jìn)行異源分泌表達(dá)并初步研究了其催化特性，為繼續(xù)探究其底物特異性揭示解其環(huán)境適應(yīng)性的可能原因打下基礎(chǔ)，以期獲得生物化工和食品化工領(lǐng)域應(yīng)用的UPO酶制劑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒

畢赤酵母表達(dá)菌株GS115，質(zhì)粒pPIC9K均為本實(shí)驗(yàn)室保存，大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自唯地生物科技有限公司。

1.1.2 生化試劑

限制性內(nèi)切酶BamHI，高保真DNA聚合酶購(gòu)自TaKaRa大連生物工程公司；無縫克隆試劑盒購(gòu)自中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；Westernblot的一抗為小鼠抗His-tag單克隆抗體，二抗為山羊抗小鼠IgG（H&L）二抗（HRP標(biāo)記），均購(gòu)自金瑞斯生物科技公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

EDG-810型PCR儀，東勝創(chuàng)新生物技術(shù)科技有限公司；生化培養(yǎng)箱，重慶市永生試驗(yàn)儀器廠；DYY-8C型電泳儀，北京市六一儀器廠；SKY2102C型搖床，SUKUN；全自動(dòng)凝膠成像儀，BIO-RAD；7000D型 GC-TQ/MS，安捷倫科技有限公司；HP-INNOWax色譜柱，安捷倫科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 非特異性過氧合酶AbvbUPO序列的合成和分析

AbvbUPO基因序列（XP_006457061.1）委托上海生工生物工程有限公司合成。使用DNAMAN軟件進(jìn)行序列的對(duì)比，使用ESPript[11]（網(wǎng)站）呈現(xiàn)同源比對(duì)結(jié)果。

1.2.2 非特異性過氧合酶AbvbUPO的基因克隆

利用 PCR擴(kuò)增技術(shù)獲得目的基因片段（上游引物：5’-GAGGCTGAAGCTTACGTAGAATCACCAGG TGCTCCTCCTGGA-3’；下游引物：5’-TTAATGATGA TGATGATGATGGGATCCTTAATTGTCATTCCCATA GGG-3’），擴(kuò)增條件如下：98 ℃ 5 min，98 ℃ 15 s、55 ℃ 15 s、72 ℃ 1 min 共30 個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后 72 ℃保持5 min。將BamHI單酶切后的pPIC9K載體與擴(kuò)增得到的目的基因進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)至DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中并涂布至含有100 μg/mL氨芐青霉素的固體LB平板。次日，提取重組質(zhì)粒并送往上海生工公司測(cè)序。

1.2.3 重組蛋白AbvbUPO的表達(dá)

（1）重組酵母的搖瓶發(fā)酵：將重組質(zhì)粒pPIC9K-AbvbUPO電轉(zhuǎn)化至P. pastorisGS115中，種子液按10%接種量接種至100 mL的BMGY液體培養(yǎng)基中30 ℃、200 r/min培養(yǎng)。24 h后將發(fā)酵液低溫離心，去除上清液后加入100 mL的BMMY培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，每隔24 h補(bǔ)加0.5 mL的甲醇。甲醇誘導(dǎo)72 h后停止培養(yǎng)，將發(fā)酵液進(jìn)行低溫離心，收集上清液，利用 10 ku截留超濾管進(jìn)行濃縮，濃縮后用SDS-PAGE凝膠電泳和Western blot檢測(cè)AbvbUPO在P. pastorisGS115中的表達(dá)情況。

（2）重組酵母的發(fā)酵罐發(fā)酵：二級(jí)種子液按10%接種量接種，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的二級(jí)種子液按 10%（V/V）接種到經(jīng)過高壓滅菌的5 L發(fā)酵罐中（含3 L基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基：26.7 mL/L的85%磷酸，0.93 g/L的CaSO4·2H2O，14.9 g/L的MgSO4·7H2O，18.2 g/L的K2SO4，7.13 g/L 的KOH，40 g/L的甘油，滅菌后加入 PTM1微量元素至 12 mL/L），30 ℃、800 r/min培養(yǎng)。當(dāng)基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基的甘油被消耗完時(shí)，用 50%（V/V）的甘油進(jìn)行補(bǔ)料（含12 mL/L的PTM1微量元素），流速根據(jù)溶氧（DO）調(diào)整，使溶解氧濃度保持在40%左右。當(dāng)濕重達(dá)到160 g/L時(shí)停止補(bǔ)料并饑餓培養(yǎng)1 h，饑餓培養(yǎng)結(jié)束后，將溫度設(shè)為22 ℃，pH控制在6.0左右。流加甲醇進(jìn)行低溫誘導(dǎo)使其溶氧控制在40%左右至132 h。酶液用10 ku切向流超濾膜包進(jìn)行濃縮后檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)情況和酶活力。

1.2.4 UPO活力檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)用2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）作為底物檢測(cè)AbvbUPO的酶活[12]。1個(gè)酶活力單位定義為：在25 ℃和pH 4.0條件下，每分鐘水解1 μmol底物（ABTS）生成對(duì)應(yīng)產(chǎn)物（ABTS自由基）所需的酶量為1個(gè)酶活單位(U)。

1.2.5 SDS-PAGE和Westernblot檢驗(yàn)

SDS-PAGE：將蛋白質(zhì)樣品用5%的濃縮膠濃縮，并通過 10%的分離凝膠進(jìn)行不同分子量蛋白質(zhì)的分離，最后將分離凝膠用考馬斯藍(lán)R250染色。

Westernblot：將裝有SDS-PAGE凝膠和0.2 μm聚偏二氟乙烯膜（PVDF）的電轉(zhuǎn)印夾放入電泳槽中低溫轉(zhuǎn)印。轉(zhuǎn)印結(jié)束后，PVDF膜用 5%（m/V，TBST溶解）脫脂奶粉室溫封閉2 h，然后與小鼠抗His標(biāo)簽抗體（Genscript，中國(guó)上海）一起低溫過夜孵育，孵育結(jié)束后用TBTS緩沖液清洗，隨后用山羊抗小鼠IgG（H&L）二抗（HRP標(biāo)記）孵育，最后用DAB顯色液（Solarbio，中國(guó)上海）顯色以驗(yàn)證重組 His-tag-AbvbUPO蛋白。

1.2.6AbvbUPO的酶學(xué)性質(zhì)表征

1.2.6.1 粗酶液的緩沖液置換

為了避免酶發(fā)酵液中離子成分對(duì)酶活力造成影響，進(jìn)行酶活性評(píng)估前需對(duì)原有的緩沖液進(jìn)行置換。利用10 ku孔徑截留的超濾管置換緩沖液，按照粗酶液與20 mM的磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）的比例為1:10添加磷酸鹽緩沖液，置換緩沖液多次至發(fā)酵罐緩沖液成分為微量為止。

1.2.6.2 最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性

最適反應(yīng)溫度：按照方法1.2.4的活性檢測(cè)方法，檢測(cè)25～42 ℃范圍內(nèi)AbvbUPO酶液催化ABTS的活性變化。緩沖體系為 100 mM 的磷酸鈉緩沖液（pH 4.0），反應(yīng)時(shí)間為10 min。熱穩(wěn)定性：測(cè)定AbvbUPO酶液在30、35和40 ℃下孵育10～120 min下的殘余酶活力。

1.2.6.3 最適反應(yīng)pH

以ABTS為底物，在pH范圍為3.0～7.0的緩沖液下測(cè)酶活性的變化，其他條件保持不變。其中 pH 3.0～5.0范圍所使用緩沖液為100 mM的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，pH 6.0～7.0的范圍所使用緩沖液為100 mM磷酸鹽緩沖液。

1.2.6.4 過氧化氫耐受性

將AbvbUPO酶液與不同濃度（2、5、10、20 mM）的H2O2進(jìn)行等體積孵育，孵育5 min后按照反應(yīng)體系內(nèi)H2O2等量的原則調(diào)整加入H2O2的量進(jìn)行殘余活力測(cè)定。

1.2.6.5 酶級(jí)聯(lián)催化反應(yīng)及產(chǎn)物檢測(cè)

向5 mL旋蓋玻璃瓶中依次添加400 μL的50 mM磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）、100 μL的1 M氯化膽堿溶液，充氧后，加入50 μL的100 μM膽堿氧化酶（AnChOx）酶液，400 μL的AbvbUPO酶液，5 mM乙基苯，最后用50 mM的磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）補(bǔ)足1 mL。玻璃瓶放置于恒溫油浴鍋，于反應(yīng)溫度為 30 ℃、攪拌速度為500 r/min條件下反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后用乙酸乙酯萃取，離心后取上層有機(jī)層進(jìn)行GC-MS檢測(cè)分析。

GC-MS檢測(cè)升溫條件：以10 ℃/min的升溫速率從最初的50 ℃升溫至190 ℃，保持3 min，以5 ℃/min的升溫速率從190 ℃升溫至230 ℃，然后保持6 min。

產(chǎn)物濃度的計(jì)算：精確稱取β-苯乙醇，配置成1、2、3、4、5 mM的β-苯乙醇溶液，通過對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行GC-MS檢測(cè)，根據(jù)氣相色譜圖的吸收峰繪制β-苯乙醇的濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。將萃取物中保留時(shí)間與產(chǎn)物相對(duì)應(yīng)的吸收峰代入標(biāo)準(zhǔn)曲線即得產(chǎn)物濃度，苯乙酮的含量?jī)H為相對(duì)定量。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

用Origin 8.5軟件作圖并用SPSS 9.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 非特異性過氧合酶AbvbUPO序列比對(duì)分析

對(duì)目前報(bào)道的UPO酶基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)UPO催化保守序列為 Pro-Cys-Pro（PCP）、Glu-Gly-Asp（EGD）和酸堿催化劑對(duì) Arg-Glu（R-E），其中 Arg和Glu充當(dāng)酸堿對(duì)在過氧化物酶催化活性中間體的形成起著重要的穩(wěn)定作用[8]。AbvbUPO成熟肽基因的分子量為984 bp，編碼328個(gè)氨基酸，蛋白分子量理論值大小為 35 ku，DNAMAN軟件序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)AbvbUPO 與Agrocybe aegeritaUPO（AaeUPO）、Coprinus radiansUPO和Coprinopsis cinereaUPO中氨基酸序列存在38.64%～62.93%的相似性。同源序列對(duì)比如圖1所示，AbvbUPO具有UPO的催化保守序列，即 Pro81-Cys82-Pro83，Glu168-Gly169-Asp170和Arg235-Glu242，提示AbvbUPO可能具有UPO的催化特性。

圖1 AbvbUPO的序列比對(duì)及同源性分析Fig.1 Multiple sequence alignment of AbvbUPO and its homologs

2.2 非特異性過氧合酶AbvbUPO基因克隆及表達(dá)

質(zhì)粒譜圖如圖2所示，基因片段與帶有組氨酸標(biāo)簽的pPIC9K載體連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)中。菌落PCR呈陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化子送往測(cè)序中心測(cè)序，進(jìn)一步確認(rèn)AbvbUPO成功克隆到pPIC9K載體上。

真核表達(dá)系統(tǒng)具有完善的翻譯后修飾功能，可有效提升異源表達(dá)的蛋白可溶性及活性，因此選用了畢赤酵母GS115作為表達(dá)宿主。然而畢赤酵母重組菌在搖瓶發(fā)酵中，沒有檢測(cè)出目的蛋白條帶及酶活，故將畢赤酵母重組菌在 5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行高密度發(fā)酵，Western blot結(jié)果顯示AbvbUPO在畢赤酵母GS115中表達(dá)的分子量為 35 ku（圖 3）。濃縮酶液具有氧化ABTS底物的酶活力，其 132 h發(fā)酵單位活力為45399.26 U/L。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Miguel Alcalde等[9]的研究結(jié)果一致，克隆至畢赤酵母X33的野生型AaeUPO在小型發(fā)酵中，表達(dá)量幾乎無法達(dá)到檢測(cè)限，提示野生型UPO的表達(dá)量低，小型發(fā)酵無法達(dá)到UPO的蛋白質(zhì)及酶活的檢測(cè)水平。目前，僅有AaeUPO在酵母中得以表征，Miguel Alcalde等[13]在畢赤酵母中，利用發(fā)酵罐高密度發(fā)酵AaeUPO定向進(jìn)化后的突變體PaDa-I，培養(yǎng)6 d酶活可達(dá)232000 U/L。

圖2 質(zhì)粒譜圖和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)菌落PCRFig.2 Plasmid and agarose gel electrophoresis of colony PCR

圖3 SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)重組蛋白在P. pastoris GS115中表達(dá)Fig.3 SDS-PAGE and western blot analysis of the expression of the recombinant protein in P. pastoris GS115

2.3 AbvbUPO的酶學(xué)性質(zhì)表征

2.3.1 溫度對(duì)AbvbUPO活力的影響

圖4 非特異性過氧合酶AbvbUPO最適反應(yīng)溫度Fig.4 Optimum temperature of AbvbUPO

本實(shí)驗(yàn)針對(duì)酶反應(yīng)時(shí)的最適溫度和熱穩(wěn)定性進(jìn)行考察。如圖4所示，AbvbUPO酶液的最適反應(yīng)溫度為35 ℃、30 ℃和 40 ℃可保持最大活力的 73.39～78.40%（圖4）。目前被研究最透徹的AaeUPO的最適反應(yīng)溫度為30 ℃[14,15]，其余關(guān)于UPO催化研究的報(bào)道，但研究設(shè)計(jì)溫度普遍設(shè)置在 23～40 ℃之間[3,16,17]，提示 UPO無法在高溫下實(shí)現(xiàn)高效催化反應(yīng)，AbvbUPO亦然。

酶的熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)顯示，AbvbUPO在不同溫度孵育10 min后，酶活性急劇降低，40 ℃下孵育10 min之后，僅呈現(xiàn) 52.97%的活性（圖 5），這表明該酶蛋白解折疊所需要的能量較低，推測(cè)是 UPO的普遍特征。Diana等[18]對(duì)AaeUPO的熱孵育實(shí)驗(yàn)也表明UPO的熱不穩(wěn)定性，在63 ℃孵育5 min后，AaeUPO的活力下降超過80%。提高UPO的最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性，對(duì)于UPO的研究有著重大意義。

圖5 非特異性過氧合酶AbvbUPO熱穩(wěn)定性Fig.5 Thermostability of AbvbUPO

2.3.2 溶液pH對(duì)AbvbUPO活力影響

圖6 AbvbUPO催化ABTS底物的最適pHFig.6 Optimum pH of AbvbUPO catalyzing ABTS

酶活檢測(cè)體系不變，僅對(duì)緩沖液的pH進(jìn)行調(diào)整，由于pH小于3.0時(shí)，反應(yīng)體系內(nèi)會(huì)出現(xiàn)蛋白質(zhì)析出的現(xiàn)象，故僅對(duì)pH大于3.0的緩沖液進(jìn)行比較（圖6）。結(jié)果顯示，AbvbUPO催化ABTS的最適pH為3.0～4.0，與AaeUPO[9]和Marasmius rotulaUPO（MroUPO）[19]的最適pH一致，表明該酶為酸性條件下催化ABTS活性更佳。

2.3.3AbvbUPO過氧化氫耐受性

UPO是血紅素氧化物酶（HTP），需要H2O2作為共底物，然而氨基酸可能會(huì)被 H2O2氧化，從而影響酶的活性[20]，此外，H2O2可能將血紅素氧化為α-內(nèi)消旋-羥基-血紅素，導(dǎo)致HTP的不可逆失活[21]。所以利用UPO作為生物催化劑時(shí)往往需要探索適當(dāng)?shù)腍2O2濃度以降低酶活力的損失。結(jié)果表明，AbvbUPO不適宜在高濃度 H2O2的環(huán)境下長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行生物催化，AbvbUPO被5 mM的H2O2孵育5 min后，酶活力僅為初始活性的54.98%（圖7）。據(jù)報(bào)道[8]，在不同濃度H2O2與AaeUPO共底物的催化實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)H2O2濃度大于2.5 mM時(shí)，產(chǎn)物的生成率會(huì)隨著過氧化氫濃度的升高而降低，Karich Alexander等[22]提出，UPO的活性的降低與血紅素的丟失有關(guān)，推斷是由于反應(yīng)中的羥基自由基使血紅素形成綠色素和膽綠素進(jìn)而終止催化反應(yīng)。為了更真實(shí)地反映其底物選擇性和催化潛力，需要建立一種降低反應(yīng)體系中 H2O2濃度的辦法來降低其在催化過程中的酶活損失。

圖7 AbvbUPO過氧化氫耐受性Fig.7 H2O2-tolerance of AbvbUPO

2.4 AbvbUPO參與的級(jí)聯(lián)催化反應(yīng)體系建立

圖8 AbvbUPO酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)示意圖Fig.8 Figure of AbvbUPO enzymatic cascade reaction

表1 AbvbUPO酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物得率表Table 1 Productyield of AbvbUPO enzymatic cascade reaction

如上文所述，AbvbUPO不耐受高濃度的H2O2，因此采用原位生成 H2O2的酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)代替一次性加入過量的H2O2作為共底物[14,23]。本實(shí)驗(yàn)原位生成H2O2方法（圖 8）是使用氯化膽堿作為電子供體，通過來自煙草節(jié)桿菌來源的膽堿氧化酶還原分子氧來產(chǎn)生H2O2。β-苯乙醇是一種重要的食用香精香料，被廣泛地應(yīng)用在食品風(fēng)味提升工藝之中[24]，而它的底物乙基苯也是 UPO的常用底物[14]，因此利用該催化反應(yīng)驗(yàn)證AbvbUPO級(jí)聯(lián)催化反應(yīng)活性可行性。氣質(zhì)聯(lián)用分析結(jié)果表明（圖9），保留時(shí)間為4.74 min、9.07 min和9.15 min的產(chǎn)物分別為乙基苯、β-苯乙醇及苯乙酮。AbvbUPO能夠氧化乙基苯為β-苯乙醇，且4 h內(nèi)轉(zhuǎn)化率可達(dá)14.40%，但隨后轉(zhuǎn)化率逐漸降低，推測(cè)是該酶熱穩(wěn)定性弱，長(zhǎng)時(shí)間30 ℃孵育會(huì)造成酶活力的損失，同時(shí)產(chǎn)物中伴有副產(chǎn)物苯乙酮，因?yàn)榉磻?yīng)過程中苯乙醇產(chǎn)物被AbvbUPO繼續(xù)氧化，導(dǎo)致了苯乙酮的生成。Frank Hollmann等人[5]研究AaeUPO羥基化乙基苯的反應(yīng)實(shí)驗(yàn)表明，反應(yīng)前期苯乙酮會(huì)大量增加，因?yàn)楸揭掖嫉姆e累抑制了過氧化，在反應(yīng)30～60 min時(shí)苯乙酮增長(zhǎng)速率開始下降并且趨于穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)表明，AbvbUPO能與膽堿氧化酶實(shí)現(xiàn)級(jí)聯(lián)催化反應(yīng)，使AbvbUPO在有機(jī)合成及相關(guān)領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用潛力。

圖9 GC-MS檢測(cè)AbvbUPO酶級(jí)聯(lián)催化反應(yīng)Fig.9 GC-MS analysis data of AbvbUPO enzyme cascade reaction

3 結(jié)論

本研究將來源于Agaricus bisporus var. bisporus的非特異性過氧合酶AbvbUPO為目標(biāo)蛋白，在畢赤酵母GS115中成功異源表達(dá)，并研究其催化ABTS的最適pH，最適溫度和熱穩(wěn)定性。除此之外，針對(duì)血紅素氧化酶不耐受H2O2的問題進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)AbvbUPO的H2O2耐受性較差，故通過原位H2O2生成技術(shù)，降低反應(yīng)體系中H2O2的濃度，再串聯(lián)AbvbUPO催化底物的氧化。本文研究結(jié)果為非特異性過氧合酶的異源表達(dá)和進(jìn)一步研究其底物選擇性搭建了可行的平臺(tái)。