基于NK細(xì)胞的免疫療法在癌癥治療中的應(yīng)用及其研究進(jìn)展

李翠翠 陳夢(mèng)夢(mèng) 鄒 偉，2* 張炳強(qiáng)*

（1 青島瑞思德生物科技有限公司 山東青島 266000 2 遼寧省生物技術(shù)與分子藥物研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 遼寧大連 116000）

自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞是一類具有殺傷腫瘤細(xì)胞能力的天然免疫細(xì)胞，可通過細(xì)胞毒性和釋放細(xì)胞因子等方式，抵抗病毒或腫瘤細(xì)胞的侵襲。作為人體重要的免疫細(xì)胞之一，NK 細(xì)胞在監(jiān)視腫瘤的過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，并以一種與抗原無關(guān)的方式表現(xiàn)出對(duì)異常細(xì)胞的強(qiáng)大殺傷能力。本文就NK 細(xì)胞及其功能、NK 細(xì)胞療法與傳統(tǒng)癌癥治療、癌癥免疫治療中常見的NK 細(xì)胞療法、嵌合抗原受體（chimeric antigen receptors，CAR）NK（CAR-NK）細(xì)胞4 個(gè)方面進(jìn)行簡要綜述。

1 NK 細(xì)胞及其功能

1975年，Kiessling 等[1]發(fā)現(xiàn)一類與淋巴細(xì)胞形態(tài)相似，但與T 細(xì)胞和B 細(xì)胞不同的，不需要預(yù)先刺激就能裂解腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞，并且能直接通過表面受體識(shí)別病原菌，因此，將其命名為自然殺傷細(xì)胞。NK 細(xì)胞既不需要抗原致敏，也不需要抗體參與，且無主要組織相容性復(fù)合物（major histocompatibility complex，MHC）限制。NK 細(xì)胞主要參與對(duì)病毒感染細(xì)胞、惡性轉(zhuǎn)化的自體細(xì)胞或同種異體細(xì)胞的殺傷過程，同時(shí)，能快速響應(yīng)病毒感染，參與抗腫瘤的免疫監(jiān)視過程。NK 細(xì)胞是人體抵抗病毒感染和腫瘤細(xì)胞的第一道防線，能非特異性地直接殺傷腫瘤細(xì)胞，是免疫系統(tǒng)中最重要的效應(yīng)殺傷細(xì)胞，也是固有免疫系統(tǒng)的重要成員，約占外周血淋巴細(xì)胞總數(shù)的10%～15%，同時(shí)存在于脾臟、肝臟、肺、骨髓和淋巴結(jié)中。它們通過與樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC）的相互作用發(fā)揮關(guān)鍵的免疫調(diào)節(jié)功能，DC 細(xì)胞通過激活NK 細(xì)胞，促進(jìn)其殺傷靶細(xì)胞，但反之，NK 細(xì)胞也作用于DC細(xì)胞，既促進(jìn)其成熟，又對(duì)其產(chǎn)生殺傷效應(yīng)。

根據(jù)細(xì)胞特征，人們通常將NK 細(xì)胞分為CD56brightCD16dim/-表型和CD56dimCD16+表型。前者通常不太成熟，但可分泌大量的細(xì)胞因子；而后者更成熟，占NK 細(xì)胞總數(shù)的90%，其細(xì)胞毒性更大，具有殺傷溶解靶細(xì)胞的功能，是天然抗腫瘤免疫的重要效應(yīng)細(xì)胞[2]。NK 細(xì)胞的抗腫瘤作用依賴其細(xì)胞毒性，而細(xì)胞毒作用主要通過2 種途徑殺傷腫瘤細(xì)胞：1）活化的NK 細(xì)胞釋放穿孔素和顆粒酶介導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡，啟動(dòng)凋亡相關(guān)程序；2）抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（antibodydependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）。 NK細(xì)胞被激活后，胞漿顆粒分泌穿孔素，使靶細(xì)胞的細(xì)胞膜上形成孔洞[3]；細(xì)胞膜破裂后，顆粒酶——絲氨酸蛋白酶被運(yùn)送至細(xì)胞質(zhì)中，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而NK 細(xì)胞表面具有FcγRIIC（CD32c）和FcγRIIIA（CD16a）識(shí)別受體，可與已結(jié)合在靶細(xì)胞表面的抗體Fc 段結(jié)合，從而殺傷與抗體結(jié)合的靶細(xì)胞，這一殺傷過程稱為抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。Rosenberg 等[4]最早于1985年就開始使用NK 細(xì)胞進(jìn)行抗腫瘤治療，研究發(fā)現(xiàn)，NK細(xì)胞聯(lián)合IL-2 對(duì)腎癌、黑色素瘤的治療，有效率為20%～30%。與LAK 細(xì)胞不同的是，NK 細(xì)胞治療使用的是單一細(xì)胞，而LAK 細(xì)胞是NK 細(xì)胞或T細(xì)胞在體外高劑量IL-2 誘導(dǎo)下分化的細(xì)胞群。

2 NK 細(xì)胞療法與傳統(tǒng)癌癥治療

常規(guī)癌癥治療方法為手術(shù)后進(jìn)行放療、化療等，在這一過程中難免會(huì)使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激，增加NK 細(xì)胞的活化配體，釋放損傷相關(guān)分子模式分子（damage-associated molecular patterns molecules，DAMPs），誘導(dǎo)免疫原性的細(xì)胞死亡[5]。Guerriero等[6]在用DNA 烷化劑治療無胸腺小鼠的腫瘤中發(fā)現(xiàn)，需要招募中性粒細(xì)胞和NK 細(xì)胞以清除腫瘤。Ruscetti 等[7]證實(shí)絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）和周期蛋白依賴性激酶4/6（cyclin-dependent kinase4/6，CDK4/6）抑制劑聯(lián)合作用，可抑制KRAS 突變型肺癌細(xì)胞的增殖，并激發(fā)NK 細(xì)胞監(jiān)視程序，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。Gasser 等[8]用高劑量輻射導(dǎo)致DNA 損傷后發(fā)現(xiàn)，與化療作用相似，輻射也能通過ATM 和ATR依賴途徑導(dǎo)致NKG2D 配體表達(dá)量增加，使NK 細(xì)胞和活化的CD8+T 細(xì)胞表達(dá)NKG2D 受體（也稱為KLRK1 受體，是人MHC-I 配體的一種）。以上研究表明，雖然不同化療藥物（或輻射）作用機(jī)制不同，但手術(shù)切除仍然是許多惡性實(shí)體瘤的主要治療方法，而手術(shù)的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚，同時(shí)手術(shù)損害了NK 細(xì)胞的功能，從而為腫瘤的擴(kuò)散和生長提供了機(jī)會(huì)[9]。因此，NK 細(xì)胞雖然在傳統(tǒng)腫瘤治療中發(fā)揮基礎(chǔ)性作用，但在手術(shù)、放療及化療治療后其相關(guān)功能有待進(jìn)一步研究。

3 癌癥免疫治療中常見的NK 細(xì)胞療法

過繼免疫治療通過向腫瘤患者移植經(jīng)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的、從患者或健康供者體內(nèi)獲得的、自體或異體的免疫細(xì)胞，發(fā)揮直接或間接地殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，達(dá)到治療腫瘤的目的。

3.1 自體NK 細(xì)胞 目前，自體NK 細(xì)胞用于癌癥免疫治療，雖然NK 細(xì)胞可從患者的外周血中分離，可在體外擴(kuò)增，但研究顯示，NK 細(xì)胞的擴(kuò)增比T 細(xì)胞的擴(kuò)增更為復(fù)雜。Sakamoto 等[10]發(fā)現(xiàn)用自體NK 細(xì)胞對(duì)消化癌患者進(jìn)行治療，盡管體外擴(kuò)增至4 720 倍，NK 細(xì)胞在體外具有高度溶解活性，并強(qiáng)烈表達(dá)功能標(biāo)記物（例如，NKG2D 和CD16），依然沒有觀察到臨床反應(yīng)。同時(shí)，自體NK 細(xì)胞的功能狀態(tài)和增殖往往較差[11]，這可能與NK 細(xì)胞分離前患者所接受的治療有關(guān)，使其成為臨床療效較差的原因之一。針對(duì)這一問題，目前正在研究多種方法包括不同的激活細(xì)胞因子組合（例如，IL-2、IL-12、IL-15、IL-18），體外擴(kuò)增過程中使用飼養(yǎng)細(xì)胞提供重要的細(xì)胞因子等[12]。

3.2 同種異體NK 細(xì)胞 由于癌癥患者的NK 細(xì)胞功能高度失調(diào)，并且數(shù)量減少，因此，在癌癥免疫治療中，廣泛探索了同種異體NK 細(xì)胞的過繼移植治療，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生抗腫瘤的效應(yīng)。Miller等[13]在進(jìn)行異體NK 細(xì)胞回輸?shù)呐R床實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，免疫抑制的AML 患者回輸NK 細(xì)胞，并進(jìn)行IL-2治療后，IL-15 升高、NK 細(xì)胞數(shù)量增加，19 名患者中有5名患者的疾病得到緩解。人細(xì)胞系NK-92已被廣泛用于異體NK 細(xì)胞治療的臨床研究。Tonn 等[14]的臨床研究顯示，將NK-92 細(xì)胞分2 次輸注15 名處于具有耐藥性的惡性腫瘤（肺癌、白血病、淋巴瘤）晚期患者，間隔48 h 后，75%的癌癥患者產(chǎn)生一定的抗腫瘤反應(yīng)，表明NK-92 細(xì)胞具有較好的療效。但若將NK-92 細(xì)胞作為癌癥治療的一種新方法，仍需要大量研究驗(yàn)證其安全性。

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）也能分化為NK 細(xì)胞，此種來源的NK細(xì)胞，無論在體內(nèi)或體外，均證實(shí)對(duì)各種來源的腫瘤具有極高的細(xì)胞毒性[15]。Zeng 等[16]發(fā)現(xiàn)外周血iPSCs 來源的NK 細(xì)胞在體外人殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體（killer cell immunoglobulin-like receptors，KIRs）的表達(dá)雖然較低，但對(duì)癌細(xì)胞同樣具有細(xì)胞毒性，并可能產(chǎn)生ADCC，表明外周血iPSCs 可能作為產(chǎn)生NK 細(xì)胞的替代來源。

眾多臨床研究證實(shí)，同種異體NK 細(xì)胞不會(huì)引起移植物抗宿主?。╣raft-versus-host disease，GVHD）[17]，表明同種異體NK 細(xì)胞的過繼細(xì)胞治療是安全的。與自體NK 細(xì)胞過繼細(xì)胞治療相似，同種異體NK 細(xì)胞過繼細(xì)胞治療體外培養(yǎng)的NK 細(xì)胞擴(kuò)增激活，回輸體內(nèi)后持續(xù)存在。

4 嵌合抗原受體NK（CAR-NK）細(xì)胞

由于受NK 細(xì)胞數(shù)量少、細(xì)胞毒性低和無法遷移至腫瘤部位等多種因素的影響，使未修飾的自體或異體NK 細(xì)胞過繼移植的臨床應(yīng)用受到限制。因此，對(duì)NK 細(xì)胞進(jìn)行基因工程修飾使其表達(dá)高親和力受體（例如，CD16）、靶向表面蛋白（例如，PD-L1、CD19、Her2 等）和內(nèi)源性細(xì)胞因子（例如，IL-2和IL-15）對(duì)NK細(xì)胞存活和細(xì)胞毒性至關(guān)重要。

嵌合抗原受體技術(shù)是基因工程與免疫療法的完美融合，是當(dāng)前腫瘤治療領(lǐng)域最具前景的研究方向之一。CAR 通常編碼在慢病毒結(jié)構(gòu)中，由細(xì)胞外抗原靶向結(jié)構(gòu)域（外結(jié)構(gòu)域）、跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)域3 個(gè)主要結(jié)構(gòu)域組成，它們可建立新的激活途徑，以增強(qiáng)靶細(xì)胞的溶解。

鑒于CAR-T 細(xì)胞的成功，CAR 現(xiàn)被用于增強(qiáng)NK 細(xì)胞抗腫瘤活性。2005年，Imai 等[18]利用基因修飾技術(shù)，將CAR-NK 細(xì)胞表面克服了自身的抑制受體，開啟了NK 細(xì)胞基因修飾的先河。CARNK 細(xì)胞不僅通過CAR 特異性識(shí)別腫瘤表達(dá)的抗原，也可通過NK 細(xì)胞自身受體清除腫瘤。除了通過靶向腫瘤抗原指導(dǎo)CAR-NK 細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞外，已有人提出CAR-NK 細(xì)胞可清除腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制細(xì)胞，包括骨髓源性抑制細(xì)胞（myelodi-derived suppressor cells，MDSCs）和M2 型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associa-ted macrophages，TAMs）[19]。針對(duì)復(fù)發(fā)性或難治性CD19 陽性B 細(xì)胞惡性腫瘤患者的CD19 靶向CAR-NK 細(xì)胞治療的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)（NCT03056339）中期結(jié)果顯示，11例患者中有8 例對(duì)治療有客觀反應(yīng)，并未出現(xiàn)主要毒性反應(yīng)[20]。

5 小結(jié)

作為一種具有快速、有效的抗腫瘤能力的特殊免疫表達(dá)細(xì)胞群，無論是否使用CAR，過繼性NK細(xì)胞的移植均可提供一種更安全、更可行的替代方法，至少可作為基于T 細(xì)胞治療方法的補(bǔ)充。NK細(xì)胞易于獲取、來源更多，使利用自體或異體NK細(xì)胞治療疾病具有很大的潛力，特別是能增強(qiáng)免疫療法的抗癌效果，并降低免疫治療的毒性反應(yīng)。