2'-巖藻糖基乳糖預(yù)防嬰幼兒壞死性小腸結(jié)腸炎及感染性腹瀉的研究進(jìn)展

陸夢(mèng)蘭，陳財(cái)龍，徐加英，石羽杰，蘇紅文，劉 彪，秦立強(qiáng),

（1.蘇州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇蘇州 215123；2.蘇州大學(xué)放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)學(xué)院，江蘇蘇州 215123；3.內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司金山分公司，內(nèi)蒙古呼和浩特 010110）

母乳成分獨(dú)一無(wú)二，包含各種生物活性物質(zhì)。母乳低聚糖（human milk oligosaccharides, HMOs）是母乳中一種特殊的碳水化合物，是母乳中除乳糖和脂肪以外的第三大成分，由單糖及衍生物、唾液酸等結(jié)構(gòu)單元通過(guò)糖苷鍵連接而成[1]。隨著國(guó)外首次實(shí)現(xiàn)HMOs的商品化應(yīng)用，使得HMOs研究成為母乳研究的一大熱點(diǎn)，具有巨大的學(xué)術(shù)與經(jīng)濟(jì)價(jià)值。2'-巖藻糖基乳糖（2'-fucosyllactose, 2'-FL）作為HMOs的主要成分之一，具有調(diào)節(jié)腸道菌群、抗菌黏劑、免疫調(diào)節(jié)劑等重要的生物學(xué)功能[2?3]。

壞死性小腸結(jié)腸炎（necrotizing enterocolitis，NEC）是早產(chǎn)兒常見(jiàn)的一種非炎性小腸紊亂，早產(chǎn)兒NEC的高發(fā)病率與腸道發(fā)育不成熟密切相關(guān)，并受飲食和細(xì)菌定植的影響[4]。嬰幼兒消化和免疫功能不全、腸道發(fā)育不成熟還是導(dǎo)致腹瀉病的重要原因。2'-FL不僅可以作為益生元，還可能作為抗黏附抗菌劑和腸上皮細(xì)胞及免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)劑，通過(guò)調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和腸道菌群對(duì)NEC和腹瀉病產(chǎn)生顯著影響[5]。因此，本文綜述了2'-FL的安全性及調(diào)節(jié)腸道菌群與免疫系統(tǒng)，尤其是其對(duì)嬰幼兒NEC和感染性腹瀉的預(yù)防作用。

1 母乳中的2'-FL

目前已鑒定出約200種HMOs分子，以中性的巖藻糖基化HMOs為主，2'-FL約占泌乳母親HMOs總量的30%，由乳糖的半乳糖殘基通過(guò)α-1,2鍵連接巖藻糖而形成。在不同婦女及整個(gè)哺乳期，HMOs的種類和含量不同，泌乳早期較高，并隨時(shí)間逐漸降低[6]。HMOs隨母乳直接進(jìn)入小兒消化系統(tǒng)，只有不到5%被消化分解，絕大部分以原型隨尿排出。

HMOs的組成反映了Lewis血型特征和泌乳狀態(tài)，取決于某些糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)。血型特征決定了特異性的巖藻糖轉(zhuǎn)移酶2（FUT2）和FUT3的表達(dá)。分泌型母乳具有豐富的2'-FL和其他α1-2-巖藻糖化HMOs。相反，非分泌型母乳因缺乏FUT2，不含或者僅含少量2'-FL和其他α1-2-巖藻糖化HMOs[7?8]。另外，地理?xiàng)l件和環(huán)境因素也會(huì)影響HMOs中2'-FL的含量[1]。

2 2'-FL的安全性

在一項(xiàng)幼年大鼠亞慢性毒性研究中，使用不同劑量的2'-FL連續(xù)灌胃90 d，對(duì)照組采用目前認(rèn)為安全并被批準(zhǔn)用于嬰兒配方奶的果寡糖。根據(jù)整體觀察、體重、攝食量、眼底檢查、器官重量、組織病理學(xué)綜合評(píng)價(jià)，5000 mg/kg無(wú)任何不良反應(yīng)，因此該劑量為未觀察到有害作用水平（NOAEL），6000 mg/kg高劑量干預(yù)在體外也未檢測(cè)到致突變性[9]。大量的臨床試驗(yàn)評(píng)估了復(fù)雜的HMOs混合物用于嬰幼兒食品的安全性，只有少數(shù)考慮了補(bǔ)充2'-FL配方的效果。潘麗娜等[10]用1 g/kg和2 g/kg 2'-FL的配方奶粉飼喂小鼠28 d，不但對(duì)小鼠的生長(zhǎng)性能無(wú)影響，還提高了粗脂肪、鈣、磷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化利用率。一項(xiàng)具有前瞻性的隨機(jī)對(duì)照研究評(píng)估了含0.2 g/L或1.0 g/L的2'-FL與含2.2 g/L或1.4 g/L的低聚半乳糖的嬰兒配方奶粉對(duì)美國(guó)28個(gè)地區(qū)從出生到4個(gè)月期間健康足月兒生長(zhǎng)的耐受性和安全性，母乳喂養(yǎng)或64.3 kcal/dL配方奶喂養(yǎng)的嬰兒在體重、長(zhǎng)度和頭圍方面沒(méi)有顯著差異，未發(fā)生不良事件，而且配方奶粉和母乳喂養(yǎng)嬰兒的2'-FL吸收代謝情況相似[11]。添加2'-FL的配方奶粉喂養(yǎng)的嬰兒具有正常的生長(zhǎng)模式和排便。目前還沒(méi)有關(guān)于2'-FL不良反應(yīng)的報(bào)道。因此，2'-FL是一種安全的嬰兒配方奶粉的補(bǔ)充劑。

2'-FL的化學(xué)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，可以通過(guò)工業(yè)手段規(guī)模生產(chǎn)。目前以基因工程方法為主，通過(guò)大腸桿菌菌株和酵母的微生物發(fā)酵產(chǎn)物生產(chǎn)2'-FL[12?14]。美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）將2'-FL、2'-O-巖藻糖基乳糖（2'-O-FL）和乳糖-N-新四糖（LNnT）三種 HMOs分類為安全的嬰兒配方奶粉添加物。歐盟視HMOs為新型食品，2'-FL和LNnT均已通過(guò)安全性評(píng)價(jià)[15]。2019年歐洲食品安全局（EFSA）對(duì)2'-FL進(jìn)行了評(píng)估[16]：“對(duì)于1歲以上的幼兒2'-FL和二巖藻糖乳糖（DLF）混合物用于嬰兒配方奶粉、嬰幼兒食品中，每日最大攝入量不超過(guò)4 g是安全的”。因此，2'-FL添加于嬰兒配方奶粉有良好的前景。

3 2'-FL對(duì)腸道成熟及腸道菌群的影響

2'-FL能刺激上皮細(xì)胞的成熟，2'-FL單獨(dú)或與3'-FL、6'-唾液酸乳糖（6'-SL）聯(lián)合使用均可降低細(xì)胞增殖，增加腸上皮HT-29和Caco-2Bbe細(xì)胞的分化[17]。健康乳鼠口服2'-FL僅僅8 d就能顯著提高小腸絨毛高度和面積，絨毛寬度也有增加趨勢(shì)[18]。另外，用2'-FL和3'-SL干預(yù)大鼠8周后，明顯增加了雌鼠盲腸重量和腸道通透性，并上調(diào)維持腸道屏障功能的重要基因mRNA表達(dá)，而且干預(yù)改善了雄鼠和雌鼠的腸道菌群的組成，有益腸道微生物增多[19]。因此，2'-FL能促進(jìn)腸道成熟，并與調(diào)節(jié)腸道菌群有關(guān)。

嬰兒出生時(shí)胃腸道從母親和周圍環(huán)境中獲得乳酸菌、腸桿菌和鏈球菌定植，一周后出現(xiàn)雙歧桿菌、擬桿菌和梭狀芽胞桿菌。最近的一項(xiàng)縱向研究隨訪了5周齡嬰兒至6~11歲，糞便微生物群分析結(jié)果表明，飲食是13周齡以后嬰兒微生物群組成最重要的決定因素，母乳喂養(yǎng)的嬰兒與嬰兒配方奶粉喂養(yǎng)的嬰兒腸道菌群組成不同[20]。順產(chǎn)分娩和母乳喂養(yǎng)的嬰兒往往免疫疾病發(fā)生率低，微生物群組成更健康，其腸道中雙歧桿菌和乳酸菌占據(jù)主導(dǎo)地位，而大腸桿菌和其他兼性厭氧微生物則處于劣勢(shì)。停止母乳喂養(yǎng)后，母乳喂養(yǎng)和配方奶喂養(yǎng)的嬰兒之間差異消失[21]。早產(chǎn)兒糞便中變形桿菌的相對(duì)豐度增加，厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度降低，因此，優(yōu)化早產(chǎn)兒腸道菌群是預(yù)防NEC的一種新策略[22]。2'-FL能提高雙歧桿菌在腸粘膜上黏著能力[23]，并選擇性地促進(jìn)雙歧桿菌的生長(zhǎng)，主要是長(zhǎng)雙歧桿菌和兩歧雙歧桿菌，還可以刺激一些擬桿菌種類的生長(zhǎng)[24?25]。這些細(xì)菌會(huì)產(chǎn)生短鏈脂肪酸等代謝產(chǎn)物，降低腸道的pH，促進(jìn)腸上皮細(xì)胞再生，影響微生物群落的組成，限制有害微生物的生長(zhǎng)和定植[26?27]。體外研究顯示在含2'-FL的培養(yǎng)基上沒(méi)有腸道桿菌科菌株生長(zhǎng)，而含低聚半乳糖的培養(yǎng)基上包括病原體在內(nèi)的一些腸道桿菌菌株生長(zhǎng)良好[28]。另一項(xiàng)體外研究則發(fā)現(xiàn)大腸桿菌可同化利用攝入2'-FL后產(chǎn)生大量的醋酸鹽從而使其相對(duì)豐度顯著增加[29]?？傊?，2'-FL能增加有益菌比例和菌群豐度、促進(jìn)腸道成熟，從而保護(hù)腸道免受外界刺激的損傷。

4 2'-FL的免疫調(diào)節(jié)作用

早期的研究認(rèn)為2'-FL通過(guò)增加腸道中有益微生物的數(shù)量，從而增加了抗炎細(xì)胞因子、降低促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，調(diào)節(jié)嬰兒的免疫系統(tǒng)。但體外研究結(jié)果表明，2'-FL可以直接影響免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子[30]。HMOs調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生，促進(jìn)T細(xì)胞反應(yīng)向更平衡的Th1/Th2細(xì)胞因子轉(zhuǎn)變[31]。2'-FL通過(guò)誘導(dǎo)IL-10（+）T調(diào)節(jié)細(xì)胞和穩(wěn)定肥大細(xì)胞減輕食物過(guò)敏癥狀[32]。粘膜中樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)的特殊糖結(jié)合蛋白可識(shí)別人乳低聚糖，發(fā)揮生理和免疫作用。2'-FL與樹(shù)突狀細(xì)胞特異性C型凝集素樣細(xì)胞表面受體結(jié)合，直接與先天免疫細(xì)胞相互作用，從而改善了嬰兒的適應(yīng)性免疫[33]。2'-FL可以通過(guò)支持細(xì)菌CpG DNA調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞釋放半乳糖凝集素和TGF-βl的作用，促進(jìn)腸道黏膜免疫發(fā)育[34]。

2'-FL還是固有性免疫系統(tǒng)的激活物，直接抑制炎癥信號(hào)。在1型菌毛腸毒素性大腸桿菌侵襲的腸上皮細(xì)胞模型中，2'-FL通過(guò)調(diào)節(jié)CD14表達(dá)，抑制了脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[35]。在鼠流感疫苗接種模型中，2'-FL飲食改善了疫苗接種小鼠的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，顯著增加小鼠脾臟細(xì)胞中疫苗特異性CD4+和CD8+T細(xì)胞以及γ干擾素[36]。因此，2'-FL對(duì)固有免疫與獲得性免疫都具有一定的調(diào)節(jié)作用。

5 2'-FL對(duì)壞死性小腸結(jié)腸炎的作用

NEC嚴(yán)重威脅出生體重極低嬰兒的生命安全。母乳喂養(yǎng)、提高母乳質(zhì)量、標(biāo)準(zhǔn)化喂養(yǎng)制度可降低NEC的發(fā)生率，而長(zhǎng)時(shí)間不進(jìn)食與NEC發(fā)病率和嚴(yán)重程度增加有關(guān)，因此出生后應(yīng)盡快進(jìn)行母乳喂養(yǎng)[37?39]。NEC的特點(diǎn)是腸缺血和壞死，其發(fā)病與人工喂養(yǎng)、微生物失調(diào)和過(guò)度炎癥等有關(guān)，因此，降低促炎因子，誘導(dǎo)血管舒張分子內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）表達(dá)，保護(hù)小腸黏膜結(jié)構(gòu)、維持腸系膜灌注，可以在一定程度上減少NEC的發(fā)生發(fā)展[40?41]。一些動(dòng)物模型研究了2'-FL對(duì)NEC的保護(hù)作用。2'-FL能減少NEC模型新生小鼠和仔豬的凋亡、炎癥反應(yīng)、體重減輕和組織學(xué)改變，從而降低NEC的發(fā)生發(fā)展，其分子機(jī)制是2'-FL降低了TLR4介導(dǎo)的NF-κB 炎癥信號(hào)[42?43]。2'-FL 還降低了 NEC 新生小鼠的促炎因子水平并保留了小腸黏膜結(jié)構(gòu)，但2'-FL不能保護(hù)eNOS敲除小鼠或預(yù)先給予eNOS小鼠的NEC，進(jìn)一步說(shuō)明eNOS在改善NEC中的作用[42?43]。用低溫低氧誘導(dǎo)小鼠幼崽N(yùn)EC后給予2'-FL，僅3 d就能降低腸上皮細(xì)胞TLR4的表達(dá)，加速隱窩細(xì)胞的更新，保護(hù)腸上皮細(xì)胞免受損傷[44]。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)雖然發(fā)現(xiàn)2'-FL保護(hù)NEC，但其程度不及混合HMOs[45]。用富含2'-FL的嬰兒配方乳喂養(yǎng)剖腹早產(chǎn)豬5 d，2'-FL組出現(xiàn)NEC的比例低于對(duì)照組（50%vs.71%），但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，兩組腸道微生物群、腸結(jié)構(gòu)和消化功能也無(wú)顯著差異，這可能是早產(chǎn)豬腸道的定殖和腸道免疫還不成熟[46]。一項(xiàng)多中心臨床隊(duì)列研究顯示，發(fā)生NEC的極低出生體重兒的母乳中的HMOs各組分，除了二唾液酸乳糖-N-四糖濃度明顯降低，其他組分與對(duì)照組無(wú)明顯差異[47]。也有證據(jù)表明，在早產(chǎn)兒出生后幾周的配方奶中添加2'-FL對(duì)NEC敏感性沒(méi)有影響。當(dāng)腸道已經(jīng)適應(yīng)喂養(yǎng)和細(xì)菌定植時(shí)，將2'-FL引入早產(chǎn)兒的喂養(yǎng)可能更有利于改善腸道健康。2'-FL對(duì)NEC的效果還需要進(jìn)一步研究。

6 2'-FL對(duì)感染性腹瀉病的作用

在低收入和中等收入國(guó)家，腹瀉仍然是5歲以下兒童患病和死亡的主要原因。針對(duì)五種病原體（輪狀病毒、志賀氏菌、耐熱性腸毒素大腸桿菌、隱孢子蟲(chóng)、典型的腸道致病性大腸桿菌）采取干預(yù)措施，可大大減輕中度至重度腹瀉的負(fù)擔(dān)[48]。許多病毒、細(xì)菌或原生動(dòng)物病原體需要附著在粘膜表面，在宿主上定植或入侵引起腹瀉。攝入2'-FL可使耐熱性腸毒素大腸桿菌在小鼠腸道的定植率降低90%以上，并可降低腸道炎癥，增加糞便短鏈脂肪酸含量，增強(qiáng)腸道屏障功能，預(yù)防耐熱性腸毒素大腸桿菌感染[49]。另外一個(gè)研究也發(fā)現(xiàn)2'-FL能顯著抑制產(chǎn)腸毒素大腸桿菌F18定植于仔豬腸上皮細(xì)胞，但對(duì)減緩F18感染的仔豬腹瀉的作用有限[50]。2'-FL不但能提供非致病性共生體競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)控制病原體，而且還可以直接與病原體結(jié)合，減少腸道上皮表面接觸微生物。大腸桿菌的熱穩(wěn)定性腸毒素STa通過(guò)與腸道粘膜結(jié)合的冠苷酸環(huán)化酶結(jié)合并刺激其產(chǎn)生cGMP而引起腹瀉。在人結(jié)腸腺癌T84細(xì)胞中，2'-FL與冠苷環(huán)化酶受體結(jié)合，抑制了STa引起的氯離子穩(wěn)態(tài)失衡[51]。2'-FL還能抑制彎曲桿菌在小鼠體內(nèi)定植，抑制侵襲性致病性彎曲桿菌在體外與人腸道粘膜的結(jié)合[52]。

諾如病毒是嬰兒腹瀉的主要原因之一。在感染過(guò)程中，2'-FL通過(guò)模仿組織血型抗原（HBGAs）并結(jié)合在HBGA口袋中作為天然誘餌，阻止諾如病毒與其他血型抗原受體結(jié)合，保護(hù)嬰兒免受諾如病毒的感染[53]。LAUCIRICA等[54]驗(yàn)證了 4種 HMOs在人諾如病毒G1P[8]和G2P[4]感染的非洲綠猴腎上皮細(xì)胞（MA104細(xì)胞）中的作用，在感染開(kāi)始加入2'-FL使 G1P[8]的傳染力下降 62%，但 3'-唾液乳糖（3'SL）+ 6'-唾液乳糖（6'SL）降低 G2P[4]傳染力的能力更明顯。因此，在配方乳中添加2'-FL有利于人工喂養(yǎng)的嬰兒預(yù)防感染性腹瀉病。

7 小結(jié)

2'-FL是HMOs的主要成分之一，動(dòng)物和人群研究沒(méi)有發(fā)現(xiàn)添加2'-FL的副作用，2'-FL有益于嬰幼兒腸道菌群和免疫系統(tǒng)發(fā)展成熟。配方奶粉中添加2'-FL對(duì)嬰幼兒腹瀉病和壞死性小腸結(jié)腸炎有一定的保護(hù)作用。深入研究2'-FL對(duì)免疫系統(tǒng)和腸道微生物的有益作用機(jī)制，有助于為早產(chǎn)兒或易患病的特定嬰兒群體開(kāi)發(fā)新型和更有針對(duì)性的2'-FL嬰兒配方奶粉。添加2'-FL雖然可行，但還需要大規(guī)模的隊(duì)列研究以及以NEC為主要結(jié)局的隨機(jī)臨床試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證其效果及長(zhǎng)期適應(yīng)性和耐受性。此外，還需要進(jìn)行臨床前動(dòng)物研究以探究其作用機(jī)制，以及2'-FL補(bǔ)充的最佳時(shí)間。另外，利用HMOs作為益生元對(duì)菌群可能存在選擇性，6種母乳低聚糖的混合物能劑量依賴性地限制細(xì)胞因子誘導(dǎo)的FD4易位，并提高腸上皮屏障保護(hù)能力，2'-FL則發(fā)揮了關(guān)鍵作用[55]。因此，2'-FL與其他寡糖組合作為嬰兒配方奶粉的補(bǔ)充劑也具有深遠(yuǎn)意義，需進(jìn)一步研究其相互作用。最后，中國(guó)母乳HMOs數(shù)據(jù)有限，我國(guó)還缺乏2'-FL在食品行業(yè)中使用的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，制備2'-FL的菌種選擇、工藝路線設(shè)計(jì)、產(chǎn)品形態(tài)等均沒(méi)有定論，因此，亟需國(guó)內(nèi)研究機(jī)構(gòu)和企業(yè)從基礎(chǔ)理論到產(chǎn)品研發(fā)進(jìn)行原創(chuàng)性研究，為特定的嬰兒目標(biāo)群體制定配方，服務(wù)于嬰幼兒健康成長(zhǎng)。