口蹄疫病毒復(fù)制復(fù)合體的研究進(jìn)展

胡建軍，沈超*

（1.武漢大學(xué) 病毒學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430072；2.武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，湖北武漢 430072）

口蹄疫病毒（Foot-and-Mouth Disease Virus，F(xiàn)MDV）是小RNA病毒科口蹄疫病毒屬的成員，為單股正鏈RNA病毒；全基因組共8 500 nt，編碼一個(gè)多聚蛋白。在細(xì)胞內(nèi)，該多聚蛋白被蛋白酶連續(xù)切割，產(chǎn)生成熟的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，組成病毒外殼和復(fù)制“機(jī)器”，但非結(jié)構(gòu)蛋白并不出現(xiàn)在成熟的病毒粒子中[1]。FMDV主要感染豬、牛、羊等偶蹄動(dòng)物，導(dǎo)致宿主出現(xiàn)發(fā)熱、斑疹、跛足等嚴(yán)重的臨床癥狀。在流行地區(qū)采取的主要措施是接種疫苗，但現(xiàn)有的疫苗只能預(yù)防FMDV的感染，無(wú)法清除已感染宿主體內(nèi)的病毒。目前，對(duì)于已感染動(dòng)物采取的措施是全部銷毀，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，抑制病毒基因組RNA復(fù)制，清除宿主體內(nèi)的病毒或可成為治療FMDV的良好策略[2]。

許多單股正鏈RNA病毒感染細(xì)胞后，在病毒蛋白和被劫持的宿主因子作用下導(dǎo)致內(nèi)膜系統(tǒng)重塑，形成一種被稱為復(fù)制復(fù)合體的膜狀結(jié)構(gòu)促進(jìn)這些病毒基因組的復(fù)制，協(xié)調(diào)病毒復(fù)制周期，保護(hù)病毒RNA逃避宿主免疫應(yīng)答，對(duì)病毒的感染至關(guān)重要[3-4]。FMDV感染的宿主細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)重構(gòu)，形成了“類膜細(xì)胞器”，其中包含了一些源自FMDV的非結(jié)構(gòu)蛋白和源自宿主細(xì)胞的細(xì)胞因子[5]。暗示可能像其他單股正鏈RNA病毒一樣，復(fù)制復(fù)合體在FMDV的感染過(guò)程中也發(fā)揮著重要的作用。本文將結(jié)合近年來(lái)的相關(guān)研究，從結(jié)構(gòu)、功能、主要成分的生物學(xué)意義3方面對(duì)FMDV的復(fù)制復(fù)合體進(jìn)行介紹。

1 FMDV復(fù)制復(fù)合體的結(jié)構(gòu)

病毒作為介于生命和非生命的微小顆粒，自身并無(wú)完整的遺傳-代謝系統(tǒng)。擴(kuò)增其基因組和產(chǎn)生有傳染性的子代病毒必須依賴宿主細(xì)胞。正鏈RNA病毒的復(fù)制一般發(fā)生在由病毒蛋白和宿主細(xì)胞因子共同誘導(dǎo)產(chǎn)生的復(fù)制復(fù)合體中。FMDV的復(fù)制復(fù)合體包括一個(gè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-RNA相互作用的協(xié)調(diào)網(wǎng)絡(luò)，涉及多種病毒和宿主細(xì)胞因子。在透射電鏡下觀察FMDV感染后的IBRS-2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體腔出現(xiàn)明顯的腫脹，且在高爾基體附近出現(xiàn)大量囊泡狀結(jié)構(gòu)[6]。但關(guān)于FMDV復(fù)制復(fù)合體的三維結(jié)構(gòu)大小的測(cè)量未見報(bào)道。

2 FMDV復(fù)制復(fù)合體的功能

2.1 調(diào)控FMDV的生活周期

FMDV感染宿主細(xì)胞后，宿主細(xì)胞的核糖體亞基識(shí)別基因組RNA并以不依賴帽子的方式進(jìn)行翻譯，翻譯所得的多聚蛋白在蛋白酶的作用下切割成熟；隨后以尿苷?；腣Pg為引物，以基因組RNA為模版，轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)的負(fù)鏈RNA分子；基因組RNA與其轉(zhuǎn)錄出的負(fù)鏈RNA形成雙鏈“復(fù)制中間體”，并以負(fù)鏈RNA為模板合成大量的病毒基因組RNA，新合成的正鏈RNA又可以作為翻譯和轉(zhuǎn)錄的模板。在特定的包裝信號(hào)作用下，新合成的病毒基因組RNA與病毒蛋白外殼組裝成未成熟的FMDV粒子[7]。FMDV基因組RNA的翻譯、轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、病毒粒子的包裝等過(guò)程都發(fā)生在復(fù)制復(fù)合體中，復(fù)制復(fù)合體通過(guò)某種未被闡明的機(jī)制確保這一系列過(guò)程在宿主細(xì)胞內(nèi)高效有序的進(jìn)行。

2.2 為FMDV的生活周期提供穩(wěn)定的微環(huán)境

復(fù)制復(fù)合體作為一種“另類”的膜狀細(xì)胞結(jié)構(gòu)，一方面調(diào)控了整個(gè)膜結(jié)構(gòu)內(nèi)外的物質(zhì)交換，使得膜結(jié)構(gòu)內(nèi)部FMDV翻譯、轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、病毒粒子的組裝所需的成分維持較高的局部濃度，并提供所需的錨定位點(diǎn)，有利于這些生活周期的高效進(jìn)行[8]；另一方面，其膜結(jié)構(gòu)作為屏障使FMDV的翻譯、轉(zhuǎn)錄、復(fù)制獨(dú)立于宿主細(xì)胞，使得病毒的生活周期免受外界干擾，從而幫助病毒進(jìn)行免疫逃逸[9]。

3 FMDV復(fù)制復(fù)合體組成成分及功能

3.1 復(fù)制復(fù)合體中的脂質(zhì)及其生物學(xué)功能

脂質(zhì)是FMDV乃至所有正鏈RNA病毒復(fù)制復(fù)合體的主要成分，是復(fù)制復(fù)合體的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。與其他小RNA病毒類似，F(xiàn)MDV感染BHK細(xì)胞和IBRS-2細(xì)胞產(chǎn)生大量的囊泡。FMDV復(fù)制復(fù)合體脂質(zhì)的重要來(lái)源是內(nèi)膜系統(tǒng)的重塑，抑制Sar1的水平來(lái)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上COPⅡ轉(zhuǎn)運(yùn)膜泡的形成能抑制FMDV的感染，而抑制Arf1和Rab1的水平從而抑制高爾基體上COPⅠ轉(zhuǎn)運(yùn)膜泡和分泌膜泡的形成不能抑制FMDV的感染。給予布雷菲德菌素A（BFA）破壞高爾基體的結(jié)構(gòu)也無(wú)法抑制FMDV復(fù)制復(fù)合體的形成和病毒的感染[10]，這表明FMDV復(fù)制復(fù)合體中直接來(lái)源于宿主細(xì)胞器的部分可能是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)而非高爾基體提供。

小RNA病毒科復(fù)制復(fù)合體脂質(zhì)的另一個(gè)重要來(lái)源是利用宿主的代謝系統(tǒng)進(jìn)行合成。在受感染的細(xì)胞中，Ⅲ型磷脂酰肌醇4激酶（PI4KⅢ）產(chǎn)生高水平的PI4P，然后在復(fù)制復(fù)合體中將其轉(zhuǎn)換為膽固醇。對(duì)于許多小RNA病毒，復(fù)制復(fù)合體是在利用PI4KⅢβ的過(guò)程中在高爾基體膜上形成的，而FMDV復(fù)制不需要PI4KⅢ。在受FMDV感染的細(xì)胞中，PI4P水平不會(huì)增加，在復(fù)制復(fù)合體中也無(wú)法檢測(cè)到PI4P[10]，這表明FMDV對(duì)復(fù)制復(fù)合體膜上的脂質(zhì)有獨(dú)特的需求，但新合成的這一部分脂質(zhì)由何種細(xì)胞因子調(diào)控未見報(bào)導(dǎo)。

3.2 復(fù)制復(fù)合體中的病毒非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)及其生物學(xué)功能

復(fù)制復(fù)合體病毒自身的蛋白質(zhì)和宿主細(xì)胞中被病毒劫持的細(xì)胞因子協(xié)同作用，共同調(diào)節(jié)FMDV感染的進(jìn)程。FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白2C在小RNA病毒科復(fù)制復(fù)合體中高度保守，也是FMDV復(fù)制復(fù)合體中的關(guān)鍵蛋白[11]。Bienz等[12]研究發(fā)現(xiàn)，2C的N端具有兩親性螺旋（殘基17-34），具有結(jié)合細(xì)胞膜的能力，是膜重排和病毒復(fù)制復(fù)合體形成所必需的。2C的C端還有一個(gè)對(duì)腸病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒感染非常重要 ATPase結(jié)構(gòu)域（殘基 60～270）[13]，但 2C在FMDV的復(fù)制復(fù)合體中的功能未被闡明。Barton等[14]發(fā)現(xiàn)靠近FMDV 3A蛋白的細(xì)胞質(zhì)RNA解旋酶A（RHA）促進(jìn)了復(fù)制復(fù)合體以及細(xì)胞poly(A)結(jié)合蛋白（PABP）的組裝，免疫共沉淀證實(shí)這些蛋白質(zhì)與RHA形成復(fù)合物。Hesterberg等[15]在電鏡下觀察到宿主細(xì)胞中FMDV 3Dpol聚集在復(fù)制復(fù)合體膜上，3Dpol能與FMDV基因組RNA相互作用，其RNA依賴的RNA聚合酶（RdRp）活性是FMDV的RNA復(fù)制所必需的。小RNA病毒科中腸道病毒3C已被證實(shí)參與到復(fù)制復(fù)合體中[16]。FMDV 3C蛋白對(duì)翻譯后多聚蛋白的切割成熟和幫助病毒進(jìn)行免疫逃逸至關(guān)重要，但其是否定位于復(fù)制復(fù)合體中未見報(bào)導(dǎo)。

3.3 復(fù)制復(fù)合體中的宿主細(xì)胞因子及其生物學(xué)功能

一些宿主細(xì)胞因子也能通過(guò)與病毒的蛋白互作在復(fù)制復(fù)合體中發(fā)揮作用。Beclin1是自噬過(guò)程的調(diào)控因子,通過(guò)標(biāo)記膜形成吞噬體，參與自噬通路的啟動(dòng)并介導(dǎo)自噬體和溶酶體的融合[17]。Gladue等[18]通過(guò)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)證實(shí)Beclin1是2C的天然配體，在FMDV感染的細(xì)胞中未見溶酶體與含有病毒蛋白的自噬體的融合，過(guò)表達(dá)Beclin1后則出現(xiàn)了融合。這一現(xiàn)象表明2C可以結(jié)合Beclin1來(lái)阻止溶酶體與自噬體的融合，從而有利于病毒逃脫宿主細(xì)胞的“清理”。波形蛋白（Vimentin）已被證明在多種病毒的復(fù)制周期中起著重要的作用，與牛痘病毒和登革熱病毒的病毒復(fù)制過(guò)程有關(guān)[19-20]。Gladue等[21]證實(shí)在FMDV感染的MCF-10A細(xì)胞中，2C和Vimentin存在蛋白互作，共同參與FMDV復(fù)制復(fù)合體的形成；通過(guò)免疫熒光技術(shù)觀察到圍繞FMDV蛋白2C的Vimentin籠狀結(jié)構(gòu)的瞬時(shí)形成，破壞Vimentin的生理結(jié)構(gòu)后FMDV復(fù)制能力顯著降低。復(fù)制復(fù)合體結(jié)構(gòu)微小，成分復(fù)雜，其內(nèi)的許多成分和具體的功能仍待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論與展望

構(gòu)成FMDV復(fù)制復(fù)合體膜成分的脂質(zhì)主要有兩大來(lái)源，一是來(lái)源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜重塑，這一過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)控因子仍未確定；二是來(lái)源于脂質(zhì)的從頭合成，且不依賴于小RNA病毒科常見的PI4KⅢ，具體由何種因子調(diào)控仍未見報(bào)導(dǎo)。構(gòu)成FMDV復(fù)制復(fù)合體的另一種主要成分——蛋白質(zhì)，主要包含病毒自身的非結(jié)構(gòu)蛋白和宿主的細(xì)胞因子。參與復(fù)制復(fù)合體的病毒非結(jié)構(gòu)蛋白有2C、3A和3Dpol，3C也可能是復(fù)制復(fù)合體蛋白；Beclin 1和Vimentin是已知的屬于宿主細(xì)胞因子的復(fù)制復(fù)合體蛋白，能與2C產(chǎn)生蛋白質(zhì)互作。但這些蛋白在FMDV復(fù)制復(fù)合體中的功能仍待進(jìn)一步研究，復(fù)制復(fù)合體中許多未被確認(rèn)的成分也急需后續(xù)研究者進(jìn)行探索。

FMDV基因組的復(fù)制和產(chǎn)生有傳染性的子代病毒均與病毒復(fù)制復(fù)合體有關(guān)，復(fù)制復(fù)合體對(duì)病毒翻譯、轉(zhuǎn)錄、復(fù)制進(jìn)行時(shí)空調(diào)控，確保這些過(guò)程必需的成分保持一定的局部濃度，并保護(hù)其不受胞質(zhì)環(huán)境影響，對(duì)于FMDV的感染至關(guān)重要。闡明復(fù)制復(fù)合體的組成成分及其功能有助于更進(jìn)一步研究FMDV的感染機(jī)制和開發(fā)有針對(duì)性的治療FMDV的藥物。