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    疫情期間醫(yī)院配備新型冠狀病毒核酸檢測(cè)設(shè)備方案的探討

    2021-01-19 10:00:18顧澤華
    外科研究與新技術(shù) 2020年4期
    關(guān)鍵詞:之江磁珠核酸

    袁 勛,顧澤華,邵 蕾

    1.上海市中醫(yī)醫(yī)院醫(yī)學(xué)裝備管理處,上海 200071;2.同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院編輯部,上海 200065

    2020年4月18日,國(guó)務(wù)院印發(fā)了《關(guān)于進(jìn)一步做好疫情期間新冠病毒檢測(cè)有關(guān)工作的通知》,要求三級(jí)醫(yī)院具備獨(dú)立開(kāi)新冠病毒檢測(cè)能力。新型冠狀病毒與SARS 冠狀病毒是同一類,但不是同一種。2020年1月12日被世界衛(wèi)生組織命名為2019-nCoV,2020年2月11日被國(guó)際病毒分類委員會(huì)命名為SARS-CoV-2。

    患者在感染了新型冠狀病毒后最為常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)為咳嗽、發(fā)熱、氣促和呼吸困難等呼吸道癥狀。較為嚴(yán)重的患者可能導(dǎo)致肺炎、嚴(yán)重急性呼吸綜合征、腎衰竭,甚至死亡的情況。

    確診病例需有病原學(xué)證據(jù)陽(yáng)性結(jié)果(實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 檢測(cè)新型冠狀病毒核酸陽(yáng)性;或病毒基因測(cè)序,與已知的新型冠狀病毒高度同源)[1]。

    具備新冠疫情檢測(cè)能力就要求醫(yī)院具備二級(jí)以上實(shí)驗(yàn)室,具備核酸檢測(cè)的能力。

    1 核酸檢測(cè)原理

    1.1 原理

    除病毒之外的所有生物均由細(xì)胞所組成,核酸是在細(xì)胞核里面的一類生物聚合物,是所有已知生命均有的生物化學(xué)成分,參與遺傳物質(zhì)保存、繁殖等生化合成和細(xì)胞代謝,決定著細(xì)胞或機(jī)體的性狀表現(xiàn)。

    病毒作為最簡(jiǎn)單的一種生物,是由核酸和蛋白質(zhì)構(gòu)成。核酸由核苷酸組成,而核苷酸單體由5-碳糖、磷酸基和含氮堿基組成。如果聚合物中核苷酸的5-碳糖是核糖,則形成的聚合物是核糖核酸(簡(jiǎn)稱RNA);如果5-碳糖是脫氧核糖,則形成的聚合物是核糖核酸(簡(jiǎn)稱DNA)。

    每一個(gè)生物的核酸是不一樣的,通過(guò)核酸檢測(cè)就是要確定人身上是否帶有病毒,也就是為了檢出病毒的攜帶者。病毒攜帶者如果有癥狀的話就是患者,如果沒(méi)有癥狀就是無(wú)癥狀感染者。

    1.2 核酸檢測(cè)操作流程

    采樣→樣本包裝→樣本送檢→樣本接收→樣本保存和管理→核酸檢測(cè)(樣本前處理→核酸提取和加樣)→結(jié)果判讀與報(bào)告→檢測(cè)后樣本的處理和保存

    1.2.1 采樣要求

    鼻咽拭子:拭子貼鼻孔進(jìn)入,沿下鼻道的底部向后緩緩深入。待拭子頂端到達(dá)鼻咽腔后采集拭子,見(jiàn)圖1。將拭子頭浸入含2~3 mL 病毒保存液(也可使用等滲鹽溶液、組織培養(yǎng)液或磷酸鹽緩沖液)的管中,尾部棄去,旋緊管蓋。

    圖1 鼻咽拭子采集示意圖Fig.1 Schematic diagram of nasopharyngeal swab collection

    咽拭子:拭子放入無(wú)菌生理鹽水中濕潤(rùn)(禁止將拭子放入病毒保存液中,避免抗生素引起過(guò)敏),將拭子越過(guò)舌根,兩側(cè)咽扁桃體、咽后壁上下擦拭至少3 次,見(jiàn)圖2。將拭子頭浸入含2~3 mL 病毒保存液(也可使用等滲鹽溶液、組織培養(yǎng)液或磷酸鹽緩沖液)的管中,尾部棄去,旋緊管蓋。咽拭子也可與鼻咽拭子放置于同一管中[2]。

    圖2 咽拭子采集示意圖Fig.2 Schematic diagram of pharyngeal swab collection

    深咳痰液:要求被采集人員深咳后,將咳出的痰液收集于含3 mL 采樣液的50 mL 螺口塑料管中。如果痰液未收集于采樣液中,可在檢測(cè)前,加入2~3 mL 采樣液,或加入痰液等體積的痰消化液。

    1.2.2 病毒核酸檢測(cè)基本要求

    實(shí)驗(yàn)室按試劑說(shuō)明書編寫試劑準(zhǔn)備、病毒滅活、核酸提取、擴(kuò)增檢測(cè)、結(jié)果分析及報(bào)告等的標(biāo)準(zhǔn)操作程序,并在各個(gè)區(qū)域的操作過(guò)程中嚴(yán)格遵照?qǐng)?zhí)行。嚴(yán)禁混樣檢測(cè)。

    樣本前處理要求

    (1)在標(biāo)本制備區(qū)的生物安全柜內(nèi)取出樣本,用75%乙醇消毒樣本容器。

    (2)咽拭子和鼻咽拭子建議病毒滅活后再進(jìn)行核酸提取。

    (3)病毒滅活要求:56 ℃,滅活時(shí)間30~45 min。注意:如使用干預(yù)滅活,需保證樣本管與金屬浴管壁密切接觸。

    (4)對(duì)痰液應(yīng)充分振蕩混勻后進(jìn)行病毒滅活。

    (5)痰液如果有濃痰無(wú)法吸樣時(shí),可嘗試進(jìn)行液化處理,在滅活標(biāo)本中加入4 倍體積4% NaOH,室溫放置10 min,12000 r/min 離心5 min,去上清后加入生理鹽水懸浮,12000 r/min 離心5 min,去上清后再用生理鹽水懸浮,12000 r/min 離心5 min,去上清后留約200 μL用于核酸提取。

    1.2.3 核酸提取和加樣要求

    (1)核酸提取和加樣應(yīng)在生物安全柜內(nèi)完成。

    (2)為保證人員安全和核酸提取純度和效率,建議采用基于磁珠吸附的自動(dòng)化核酸提取方法。

    注意:需選用試劑盒內(nèi)配套或推薦的核酸抽提試劑。

    2 場(chǎng)地要求

    2.1 國(guó)家實(shí)驗(yàn)室設(shè)置、設(shè)施與環(huán)境要求

    (1)具備臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室資質(zhì)、經(jīng)過(guò)備案的生物安全二級(jí)及以上實(shí)驗(yàn)室等條件。

    (2)至少參加1 次室間質(zhì)評(píng)并合格。室間質(zhì)評(píng)結(jié)果不合格的,不允許開(kāi)展新冠病毒檢測(cè)。

    (3)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)符合生物安全有關(guān)規(guī)定,實(shí)驗(yàn)室分區(qū)應(yīng)能有效地防止擴(kuò)增產(chǎn)物和標(biāo)本間的交叉“污染”。

    2.2 醫(yī)院場(chǎng)地改造要求

    按照衛(wèi)生部辦公廳關(guān)于印發(fā)《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理辦法的通知》(衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194 號(hào))的要求與實(shí)際操作步驟需要建立采樣區(qū)、試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)。檢驗(yàn)科將原有的45 m2二級(jí)實(shí)驗(yàn)室劃分為3 個(gè)區(qū)域(試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū))。試劑準(zhǔn)備區(qū)13 m2,+10 Pa 的主要功能:試劑的制備和貯存、試劑的分裝、主反應(yīng)混合液的制備。樣本制備區(qū)22 m2,-15 Pa的主要功能:核酸(RNA、DNA)提取、貯存,擴(kuò)增反應(yīng)管的制作。擴(kuò)增區(qū)10 m2,-20 Pa 的主要功能:核酸擴(kuò)增,擴(kuò)增片段的測(cè)定。

    采樣區(qū)設(shè)置在發(fā)熱門診附近的臨時(shí)采樣篷里。為避免交叉污染,采用全新風(fēng)空調(diào)系統(tǒng);陰陽(yáng)角均用圓弧角密封處理;門必須設(shè)置自動(dòng)互鎖(機(jī)械或電子),設(shè)有專用工作服/衣柜,實(shí)驗(yàn)室的門應(yīng)有可視窗;在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)應(yīng)配備生物安全柜;設(shè)置緩沖間,緩沖間為正壓;室內(nèi)壓差值需-5 Pa~-20 Pa,見(jiàn)圖3。

    圖3 場(chǎng)地設(shè)計(jì)安排Fig.3 Space design and layout

    3 設(shè)備

    3.1 按照二級(jí)實(shí)驗(yàn)室新冠檢測(cè)要求需要配置設(shè)備

    與醫(yī)院實(shí)際情況對(duì)應(yīng),見(jiàn)表1-3。

    表1 準(zhǔn)備區(qū)所需的設(shè)備清單Tab.1 A list of equipments required for the staging area

    3.2 需采購(gòu)設(shè)備

    目前需采購(gòu)全自動(dòng)核酸提取儀1 臺(tái)、全自動(dòng)核酸檢測(cè)前處理系統(tǒng)1 臺(tái)、冰箱2 臺(tái)、氣溶膠吸附器5 臺(tái)、56 ℃水浴箱1 臺(tái)。其中自動(dòng)核酸檢測(cè)前處理系統(tǒng)最為關(guān)鍵,它是核酸檢測(cè)過(guò)程中的鏈接環(huán)節(jié)。

    4 核酸檢測(cè)儀性能對(duì)照

    以下為各型號(hào)的核酸檢測(cè)儀的參數(shù)新冠病毒核酸檢測(cè)對(duì)比,見(jiàn)表4。

    4.1 RNA提取方法比較

    4.1.1 磁珠法核酸提取

    原理:磁珠法中的細(xì)胞裂解液是一種蛋白變性劑,可使動(dòng)植物的細(xì)胞裂解,并使與DNA 或RNA 結(jié)合的蛋白質(zhì)變性,DNA 或RNA 游離釋放,磁珠可以特異地吸附DNA 或RNA,通過(guò)洗滌,去除DNA 或RNA 以外的蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì),再用洗脫液解離吸附在磁珠上的DNA或RNA,得到純度和濃度均很高的DNA或RNA[3]。

    主要步驟,見(jiàn)圖4。優(yōu)點(diǎn):(1)能夠?qū)崿F(xiàn)自動(dòng)化、大批量操作,符合生物學(xué)高通量的操作要求,使得傳染性疾病爆發(fā)時(shí)能夠進(jìn)行快速及時(shí)的應(yīng)對(duì)[4]。(2)操作簡(jiǎn)單、用時(shí)短,整個(gè)提取流程只有4步:裂解→結(jié)合→洗滌→洗脫,大多可以在36~40 min 內(nèi)完成;(3)安全無(wú)毒,不使用傳統(tǒng)方法中的苯、氯仿等有毒試劑,對(duì)實(shí)驗(yàn)操作人員的傷害減少到最少;(4)磁珠與核酸的特異性結(jié)合使得提取的核酸純度高、濃度大[5]。

    表2 標(biāo)本制備區(qū)所需的設(shè)備清單Tab.2 A list of equipment required for the specimen preparation area

    表3 擴(kuò)增分析區(qū)所需的設(shè)備清單Tab.3 A list of equipments required for the amplification and analysis area

    4.1.2 硅膠膜吸附法核酸提取

    原理:在高鹽緩沖液條件下,硅膠膜會(huì)吸附核酸,而對(duì)其他生化成分如蛋白質(zhì)、多糖、脂類既不相親也不吸附,在經(jīng)過(guò)數(shù)次緩沖洗滌離心后,吸附在膜上的DNA 或RNA 已經(jīng)很純,這時(shí)再用適當(dāng)體積的低鹽緩沖液進(jìn)行洗脫。

    主要步驟,見(jiàn)圖5。優(yōu)點(diǎn):吸附DNA的硅膠膜可以長(zhǎng)期保存,為了避免DNA 的降解,在整個(gè)DNA 提取和保存的過(guò)程中操作快速、簡(jiǎn)便、廉價(jià)。

    表4 各型號(hào)的核酸檢測(cè)儀的新冠病毒核酸檢測(cè)試劑信息Tab.4 Novel coronavirus nucleic acid test reagents of different types of nucleic acid detectors(first approved)

    4.2 陽(yáng)性判斷Ct值

    Ct 值是指在實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增過(guò)程中的熒光信號(hào)達(dá)到指數(shù)擴(kuò)增時(shí)的循環(huán)周期數(shù)。一般情況下Ct 值越大越好。

    圖4 磁珠法核酸提取步驟Fig.4 Steps for nucleic acid extraction by magnetic bead method

    圖5 硅膠膜吸附法核酸提取步驟Fig.5 Steps for nucleic acid extraction by silica gel membrane adsorption method

    4.3 靈敏度

    靈敏度=熒光采集增量/檢測(cè)樣本增量。單位樣本采集越高,靈敏度越高,核酸檢測(cè)準(zhǔn)確率也越高。結(jié)合以上3點(diǎn),之江生物的核酸檢測(cè)儀較為優(yōu)秀。

    5 采購(gòu)方案

    5.1 設(shè)計(jì)采購(gòu)方案

    明確建設(shè)核酸檢測(cè)能力的方法后,針對(duì)我院實(shí)際情況做出2套方案。

    方案一(備注:設(shè)計(jì)方案時(shí)國(guó)家衛(wèi)健委未發(fā)布公告規(guī)定必須雙靶點(diǎn)及以上):

    采購(gòu)全自動(dòng)核酸檢測(cè)分析系統(tǒng),直接出檢測(cè)報(bào)告?,F(xiàn)有檢驗(yàn)科2級(jí)實(shí)驗(yàn)室條件下不用改動(dòng)房屋設(shè)施,見(jiàn)表5。

    表5 方案一情況表Tab.5 Scenario 1

    方案二:

    原有二級(jí)實(shí)驗(yàn)室加裝一臺(tái)全自動(dòng)核酸提取儀+基因擴(kuò)增儀PCR(醫(yī)院現(xiàn)有設(shè)備),見(jiàn)表6。

    表6 方案二情況表Tab.6 Scenario 2

    5.2 確認(rèn)采購(gòu)方案

    我科室與臨床科室開(kāi)會(huì)討論,從效率、成本、合規(guī)性,安全性這4 個(gè)主要的方面對(duì)以上2 套方案進(jìn)行比較。

    5.2.1 合規(guī)性

    方案一:上海仁度單靶點(diǎn)檢測(cè),與第5期新冠疫情要求雙靶點(diǎn)以上檢測(cè)有出入,不符合要求。之江生物Autrax 全部條件都符合。方案二:全部條件都符合,臨床科室已確認(rèn)。

    上海仁度不符合國(guó)家衛(wèi)健委的要求因此不再作考慮。

    5.2.2 安全性

    方案一:之江Autrax 全程不開(kāi)蓋操作,風(fēng)險(xiǎn)較低。方案二:之江AutraMic 全程不開(kāi)蓋操作,風(fēng)險(xiǎn)較低;碩世到PCR 端需要重新加樣,風(fēng)險(xiǎn)較高;達(dá)安、PE、圣湘不開(kāi)蓋操作,風(fēng)險(xiǎn)較低。碩世需人工開(kāi)蓋操作,風(fēng)險(xiǎn)較高,因此不再作考慮。

    5.2.3 效率

    方案一:之江Autrax 為一體機(jī),無(wú)需PCR,樣本直接檢測(cè),全程無(wú)泄露,需等待88 個(gè)樣本再同時(shí)檢測(cè)。方案二:為全自動(dòng)核酸提取儀+PCR,一天檢測(cè)兩次,需要等待60-80樣本再同時(shí)檢測(cè),檢測(cè)后需要消毒,影響新冠檢查工作及時(shí)性,要準(zhǔn)備大量患者等候區(qū)域。優(yōu)點(diǎn)在于試劑可以開(kāi)放,疫情結(jié)束后,仍可檢測(cè)乙肝,丙肝等。

    5.2.4 場(chǎng)地

    方案一:之江Autrax 符合現(xiàn)有場(chǎng)地情況。方案二:之江AutraMic、PE 符合現(xiàn)有場(chǎng)地情況。達(dá)安、圣湘設(shè)備體積較大,不符合現(xiàn)有場(chǎng)地情況。

    圖6 核酸檢測(cè)結(jié)果報(bào)告Fig.6 Nucleic acid test report

    綜上所述,結(jié)合效率、合規(guī)性、場(chǎng)地與臨床科室意見(jiàn)等總體考慮,由于PE 沒(méi)有現(xiàn)貨,需等待2 個(gè)月,最終將方案二之江全自動(dòng)核酸提取儀之江AutraMic +PCR 確定為最優(yōu)方案。并需額外采購(gòu)5臺(tái)氣溶膠吸附器,放置在采樣點(diǎn),PCR實(shí)驗(yàn)室。

    在此次疫情期間,如何盡快實(shí)現(xiàn)醫(yī)院的新冠病毒核酸檢測(cè)能力是各家醫(yī)院的頭等大事。只有了解病毒原理,通過(guò)場(chǎng)地合理布局,產(chǎn)品性能比較,流程安全評(píng)估,設(shè)備及時(shí)采購(gòu),才能確保新冠病毒檢測(cè)工作的順利實(shí)現(xiàn)。

    以下是各項(xiàng)工作完成的時(shí)間節(jié)點(diǎn):

    2020年4月18日,通知下達(dá)后,院內(nèi)任務(wù)布置,展開(kāi)實(shí)地調(diào)研。

    2020年5月31日,場(chǎng)地及設(shè)備配備到位,性能驗(yàn)證完畢。

    2020年6月4日,滿分通過(guò)上海市臨床檢驗(yàn)中心審核,見(jiàn)圖6。

    2020年6月5日,靜安區(qū)辦理核酸登記。

    2020年6月10日,拿到實(shí)驗(yàn)室備案憑證。

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