母乳中脂溶性維生素的HPLC法建立及前處理方法

劉慧敏，聶琴，黃召，楊夢竹，吳夢迪，曹曉琴

江漢大學醫(yī)學院（武漢 430056）

脂溶性維生素是機體生命活動所必需的營養(yǎng)物質[1-2]，但這些營養(yǎng)素儲存在肝臟和脂肪組織中并且消除較慢，過量攝入FSV可能會對人體造成危害[3-4]。而母乳作為嬰兒的主要營養(yǎng)供給，其維生素的含量對母乳的成分組成十分關鍵[5-7]。母乳中的脂溶性維生素的測量對于保證母乳品質非常重要。

文獻通常采用高效液相色譜（HPLC）法[8-11]或熒光檢測分析[12]或液相色譜串聯(lián)質譜（HPLC-MS/MS）法[13]分析食品中的脂溶性維生素。考慮到維生素在母乳中的含量一般在毫克與微克之間，所以試驗采用簡單快速的HPLC進行檢測。然而由于母乳基質的復雜性，不同穩(wěn)定性使脂溶性維生素的提取過程至關重要，母乳中脂溶性維生素常被包被在脂肪或脂溶性雜質中，對脂溶性維生素的測定造成極大干擾[14-16]，此外，如果應用的提取方案無法有效去除脂質，高脂肪含量會影響色譜效率，縮短色譜柱壽命，降低分析物回收率。因此，對母乳中的脂溶性維生素前處理方法進行探究具有重要意義。文獻中最常用的方法為熱皂化法[17]。然而由于脂溶性維生素的不穩(wěn)定性，容易受到光、氧、熱和酸堿因素的影響，熱皂化法容易導致維生素D及類胡蘿卜素的異構化以及維生素K4和葉黃素的降解[6]。隨著技術的不斷革新，對于基質中的脂溶性維生素的提取有了更多選擇。低溫酶解皂化技術、液液萃取、固相萃取和超臨界流體萃取技術使得脂溶性維生素的提取效率明顯提高[18]。但母乳中的脂溶性維生素必須采用破壁技術釋放，常規(guī)的皂化法、酶解法和有機溶劑法等，其破壁的程度和穩(wěn)定性不同，對回收率的影響很大。試驗建立薄層層析（TLC）分離法前處理母乳中的脂溶性維生素，通過各種前處理方法比較，為測定脂溶性維生素時前處理方法的選擇提出建議，為母乳中的脂溶性維生素的測定提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

母乳（健康產婦親友捐贈）；蒙牛全脂甜奶粉（市售）；維生素A醋酸酯、維生素E對照品（純度均≥96%，上海源葉生物科技有限公司）；木瓜蛋白酶（賽國生物科技有限責任公司，批號P-3250，活性0.5～2 U/mg）；維生素C（批號20180301，華中藥業(yè)股份有限公司）；G型薄層硅膠板（批號20190205，青島海浪硅膠干燥劑有限公司）；其余試劑均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2 儀器與設備

安捷倫1220高效液相色譜儀配紫外檢測器和LC solution色譜工作站；WH-3微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司）；ME104E電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；超聲波清洗器（昆山美美超聲儀器有限公司）；旋轉蒸發(fā)器（上海申生科技有限公司）；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（河南省予華儀器有限公司）；TD6A低速離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Wonda Sil C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相，甲醇；流速0.8 mL/min；柱溫30 ℃；進樣體積10 μL；檢測波長300 nm；運行時間10 min。

1.3.2 對照品溶液的制備

標準對照品貯備液的配制。精密稱取10.0 mg維生素A醋酸酯、維生素E對照品，用1 mL甲醇溶解、定容，分別制成質量濃度10.0 mg/mL標準貯備液，-20 ℃避光保存。

混合對照品標準工作液的配制。精密量取標準貯備液各1 mL，加入空白樣品提取液中，定容到10 mL，制成質量濃度1.0 mg/mL的混合標準工作液，4 ℃避光保存。

1.3.3 供試品的制備

母乳樣品：分別于早、中、晚各取3位健康產婦的乳汁各10 mL，每位產婦的早、中、晚乳汁混勻作為供試母乳樣品。

奶粉樣品：隨機取20 g同一批號的供試品，混勻作為試樣。采用建立的檢測方法進行空白基質的篩選，測定結果為無任何干擾峰的基質作為空白基質，用于樣品添加試驗。

1.3.4 前處理條件

取10 cm×20 cm，厚度0.25 mm硅膠G板于110 ℃活化30 min備用。

準確稱取2.00 mL母乳（精確至0.01 g）至50 mL塑料離心管中，加入10 mL無水乙醇沉淀蛋白質；加入10 mL正己烷，超聲提取15 min，加入2 mL飽和氯化鈉溶液抑制乳化，混勻后以4 000 r/min離心10 min分層，取正己烷層，旋轉蒸發(fā)揮干溶劑，加入1 mL二氯甲烷，振蕩溶解殘渣。

準確稱取2.00 mg奶粉樣品（精確至0.01 g）至50 mL塑料離心管中，加入20 μL一定濃度混合標準工作液，加入2 mL 50 ℃溫水使奶粉溶解，加入10 mL無水乙醇沉淀蛋白質；后面步驟同1.3.5母乳操作步驟。

點樣。取溶液全部點于10 cm×20 cm硅膠板上，同時點標準混合工作液。

層析。用100%二氯甲烷展開劑層析，上行9 cm處取出，晾干。

顯色。使用95%乙醇-濃硫酸（1∶1，V/V）作為顯色劑，均勻噴于板面，置于105 ℃恒溫烘箱中烘10 min后取出。

收集。用刮刀刮下樣品點對應標準混合液的顯色區(qū)，用1 mL甲醇振蕩溶解，取上清液通過0.22 μm濾膜過濾。

2 結果與分析

2.1 前處理方法的選擇

2.1.1 TLC分離法的優(yōu)化

2.1.1.1 溶劑的選擇

綜合文獻[19-21]報道，分別以石油醚、正己烷、二氯甲烷為提取溶劑，以100%氯仿為展開劑，分別考察提取劑效果。結果表明，采用石油醚、正己烷、二氯甲烷分別作為提取溶劑時維生素A和維生素E的平均回收率分別為71.4%和67.1%，94.5%和92.1%，65.8%和57.1%，RSD分別為0.35%和0.41%，0.12%和0.17%，0.32%和0.27%。由此可知，采用正己烷作為提取溶劑時待測物提取回收率最高且穩(wěn)定性最好，因此選擇正己烷作為提取溶劑。

2.1.1.2 展開劑的選擇

根據(jù)文獻[19]報道，分別以環(huán)己烷-石油醚（8∶2，V/V）、100%二氯甲烷、100%氯仿為展開劑，以正己烷為提取溶劑，計算不同展開劑條件下的Rf值。結果發(fā)現(xiàn)，以100%二氯甲烷為展開劑時，能在0.5 h內使得維生素A與維生素E完全分離，并且能夠得到較好分離比，根據(jù)100%二氯甲烷展開時的Rf1=0.36，Rf2=0.92，以上述操作點樣層析上行9 cm，展開時間15 min（見圖1），維生素E上行至3.2 cm處得高約0.2 cm的橢圓形斑點，維生素A上行8.3 cm處得高約0.2 cm的圓形斑點，斑點分離度完好，Rf1=0.36，Rf2=0.92。故選擇以100%二氯甲烷為展開劑，層析上行9 cm。

圖1 不同展開劑的展開距離考察

2.1.2 幾種前處理方法的比較

為得到最優(yōu)的提取方法，依次對文獻采用的低溫酶解皂化法[21-22]、溶劑直接萃取法[23]、固相萃取法[24]分別進行試驗，同時與試驗優(yōu)化的TLC法進行比較。

通過對4種提取方法的提取回收率進行比較，溶劑直接萃取法、低溫酶解皂化法和TLC分離法提取2種維生素的平均回收率均達90%以上，而經固相萃取法后平均回收率在70%～80%之間，這與文獻[25-26]報道一致。溶劑直接萃取法和TLC分離法均采用有機溶劑直接破壁同時提取，而低溫酶解皂化法以及固相萃取法采用皂化法進行破壁處理，明顯發(fā)現(xiàn)當皂化處理奶粉樣品的時候，會造成脂溶性維生素的損失，采用酶溶液處理后再在較低溫度下破壁處理時，能減少母乳中的脂溶性維生素損失，但就相對有機溶劑破壁和提取而言，提取率仍較低。由此可見，4種前處理方法中TLC分離法能夠得到最佳回收率。

各前處理方法所得的添加混合標準品的樣品溶液HPLC色譜圖如圖2所示。TLC分離法的雜質峰數(shù)量少，而且與主成分分離度完好，不干擾主成分的出峰，為較為理想的前處理方法。

圖2 采用TLC方法得到的HPLC色譜圖

2.2 HPLC色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 檢測波長的選擇

在單一波長下采用紫外檢測器同時測定多種脂溶性維生素時需要選取最佳吸收波長，因此試驗分別吸取2 mL維生素A與維生素E的標準品儲備液于190～500 nm范圍內進行全波長掃描，結果得維生素A在324 nm處有最大吸收波長，維生素E在293 nm處有最大吸收波長，通過脂溶性維生素樣品在各波長下的分析，發(fā)現(xiàn)當檢測波長300 nm時，維生素A與維生素E均能得到較好響應值。

2.2.2 流動相的選擇

結合文獻[26-27]報道，試驗對以甲醇為基礎溶劑的溶劑體系甲醇、甲醇-水（9∶1，V/V）、甲醇-異丙醇-醋酸緩沖鹽（9∶1，V/V）作流動相時的分離效果進行考察，發(fā)現(xiàn)以甲醇-水（9∶1，V/V）為流動相進行梯度洗脫時，基線發(fā)生嚴重漂移，待測物保留時間穩(wěn)定性差；以甲醇-異丙醇-醋酸緩沖鹽（9∶1，V/V）為流動相時，基線平穩(wěn)，但維生素A出峰的時間窗內有一很強的雜質峰，會對維生素A的出峰會造成一定程度上的干擾；以甲醇為流動相時，維生素A與維生素E能在10 min內完全分離，基線平穩(wěn)，維生素A和維生素E保留時間穩(wěn)定性好，峰形完好，雜質峰與主峰分離度較好，因此試驗選擇甲醇作為流動相，維生素A的保留時間為3.65 min，維生素E的保留時間為8.02 min。

2.3 方法學考察結果

2.3.1 線性范圍，檢出限與定量限

利用配制成的空白樣品中加入混合標準溶液，按5，10，50，100，200和500 μg/L的水平添加，進樣檢測，繪制標準工作曲線。以峰面積Y對進樣質量濃度X進行線性回歸，以RSN=3計算檢出限，以RSN=10計算定量限）。以空白奶粉基質溶液添加標準品溶液，測得2種維生素的檢出限與定量限。由表1可知，2種藥物的質量濃度在5～500 μg/L范圍內，線性關系良好。

表1 維生素A和維生素E的線性回歸方程、相關系數(shù)、檢出限及定量限

2.3.2 準確度和精密度試驗

準確度用回收率表示，分別加入高、中、低3種質量濃度（5，10和20 μg/L）混合標準儲備液，按照1.3.5的樣品處理方法制備奶粉樣品，取10 μL連續(xù)進樣6次，根據(jù)峰面積，采用外標法計算回收率及RSD。通過連續(xù)5 d進行同樣的試驗，以回收率表示方法的準確度，x±s表示方法的精密度。根據(jù)分析，維生素A和維生素E的回收率82%～98%，變異系數(shù)≤15.5%。這些數(shù)據(jù)均符合分析方法標準對準確度和精密度的要求。

2.4 樣品測定

取3份母乳樣品，考慮到母乳樣品中可能含有的待測組分超過方法的線性范圍，按1.3的制備方法制備樣品，然后分別稀釋5倍進樣測定，采用外標法計算樣品中2種維生素的質量分數(shù)。根據(jù)表2顯示，3份母乳樣品中均檢出維生素A與維生素E。

根據(jù)2016版《中國居民膳食指南》規(guī)定，結合0～1歲嬰兒的母乳攝入量分析，2份母乳樣品維生素A和維生素E含量都處于0～1歲嬰兒推薦量之內。編號2母乳維生素A和維生素E含量偏高，但是還未超出0～1歲嬰兒可耐受最高攝入量。經進一步調查發(fā)現(xiàn)產婦自行加倍服用多種復合維生素，所以建議乳母要合理用藥。

表2 3份母乳樣品中維生素A和維生素E的分析結果（n=6）

3 結論

試驗建立TLC-HPLC法檢測母乳中的2種脂溶性維生素。通過前處理方法的選擇和優(yōu)化，得出TLC提取分離的最佳工藝條件。根據(jù)方法學考察結果，方法專屬性強、靈敏度高，可作為母乳中2種脂溶性維生素的有效檢測方法。通過對母乳樣品進行檢測，為哺乳期婦女的營養(yǎng)和合理用藥提供技術支持。