不同干燥方式對松露多糖含量及其抗氧化活性的影響

張存艷，魏藹玲，岳茂林，葉強，郭力，李美鳳

成都中醫(yī)藥大學藥學院西南道地藥材協(xié)同創(chuàng)新中心中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用國家重點實驗室（成都 611137）

松露，又稱“塊菌”，是一種子囊菌類大型塊狀真菌[1]，其香味獨特、營養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量普遍比較高，具有保健功能和藥用價值[2]。松露中的多糖類是被研究較多的生物活性物質(zhì)，多糖的提取率在20%左右，抗氧化活性較好[3-5]，但由于鮮松露含水量高達75.21%～79.39%[6]，在常溫下貯藏易腐爛變質(zhì)，影響其商品價值，而其干制品不但利于保存，且保留了特殊的香味。干松露包裝后保質(zhì)期可以延長至1年以上，大大增加了松露的商業(yè)價值。目前已有的關(guān)于松露的研究報道大多是關(guān)于某個營養(yǎng)成分的綜合性研究，但關(guān)于不同干燥方式對松露多糖含量及抗氧化活性的影響研究則比較少。故此次試驗考察熱風干燥、微波干燥、冷凍干燥和真空冷凍干燥4種不同的干燥方式對松露多糖含量及其抗氧化活性的影響。篩選出最適合松露的干燥方法，旨在為松露干燥方式提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

電子天平（BSA224S-CW，北京賽多利斯科學儀器有限公司）；電熱恒溫真空干燥箱（DZF-OB，上海躍進醫(yī)療器械有限公司冷凍干燥機）；旋片式真空泵（2XZ-2B，臨海市永昊真空設(shè)備有限公司）；微波干燥箱（RWBZ-08S，南京蘇恩瑞干燥設(shè)備有限公司）；超聲清洗器（SB-5200DTDN，寧波新芝生物科技股份有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-6，常州澳華儀器有限公司）；電熱恒溫鼓風干燥箱（GZIGF10，上海躍進醫(yī)療器械有限公司）；L2S可見光分光光度計（756PC，上海儀電分析儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE 52-99，上海亞榮生化儀器廠）；循環(huán)水式真空泵（SHZ-D（Ⅲ），鞏義市予華儀器有限責任公司）；密封型搖擺式粉碎機（HK-10B；上海菲恰爾分析儀器有限公司）；離心機（TDL-6A，上海菲恰爾分析儀器有限公司）。

1.2 材料與試劑

新鮮松露，四川省涼山州會東縣農(nóng)貿(mào)市場。

葡萄糖對照品、抗壞血酸對照品，成都曼思特生物科技有限公司；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2, 2’-聯(lián)氨-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽（2, 2’-azinobis（3-ehtylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS），東京化成工業(yè)株式會社；鹽酸、硫酸、苯酚、無水乙醇、過硫酸鉀、氯仿、正丁醇，成都市科龍化工試劑廠，所用試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 干燥工藝

1.3.1.1 鮮松露預(yù)處理

取鮮松露，洗去表面泥土，避免其表面出現(xiàn)損傷；待表面水分揮發(fā)后，挑選大小相近的松露，切成厚度約為0.5 cm的薄片，分成4份，供下一步處理。

1.3.1.2 真空干燥

使用真空干燥設(shè)備，干燥條件：真空度0.2 kPa，干燥溫度50 ℃，以松露含水率13%（濕基）為干燥終點，記錄干燥時間。

1.3.1.3 熱風干燥

使用電熱鼓風干燥箱設(shè)備，干燥條件：干燥溫度50 ℃，干燥風速3 m/s，以松露含水率13%為干燥終點，記錄干燥時間。

1.3.1.4 真空冷凍干燥

使用真空冷凍干燥設(shè)備，干燥條件：溫度-50℃，真空度0.2 kPa，以松露含水率13%為干燥終點，記錄干燥時間。

1.3.1.5 微波干燥

使用真空微波干燥設(shè)備，干燥條件：干燥溫度50℃，功率400 W，真空度0.2 kPa，以松露含水率13%為干燥終點，記錄干燥時間。

以上干燥完成后，需將松露密封保存于干燥器中，避免吸潮。

1.3.2 多糖提取及純化

1.3.2.1 多糖提取

采用超聲輔助法提取多糖[7-8]。將干燥后的松露粉碎，過40目篩，分別取5.0 g各干燥品粉末，置于250 mL容量瓶，以料液比1∶25（g/mL）加入蒸餾水，超聲處理50 min（140 W，60 ℃），離心10 min（4 500 r/min），取上清，下層沉淀重復(fù)以上操作。合并2次上清液，濃縮至50 mL。

1.3.2.2 多糖的純化

脫蛋白：采用Sevag法進行脫蛋白處理[9]。取適量樣品溶液，加入20%體積的Sevag試劑，振蕩后靜置20 min，離心（5 000 r/min，10 min），收集上清液，棄去中間的蛋白層和下層的有機層，重復(fù)上述操作直至無沉淀物析出。

醇沉：向脫蛋白的提取液中加入3倍體積的95%乙醇，邊加邊振搖，于4 ℃冰箱靜置過夜；離心15 min（4 500 r/min，4 ℃），收集沉淀。

透析：將上述沉淀溶解于適量體積的蒸餾水，置于分子量截留量為12 000 Da的透析袋中，超純水透析3d，以除去小分子物質(zhì)。

冷凍干燥：將透析后的溶液離心10 min（4 000 r/min），收集沉淀，于-20 ℃冰箱預(yù)凍24 h，轉(zhuǎn)移至真空冷凍干燥箱，24 h后取出，稱質(zhì)量，多糖提取率按式（1）計算。

式中：m1為稱量瓶質(zhì)量，g；m2為稱量瓶及多糖質(zhì)量，g；m3為松露質(zhì)量，g。

1.3.3 多糖含量測定

1.3.3.1 葡萄糖標準曲線的繪制

采用苯酚-硫酸法[10]。準確稱取10 mg葡萄糖標準品，置于100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，即得質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖標準品溶液。分別吸取0，0.20，0.40，0.60，0.80和1.00 mL葡萄糖標準溶液于具塞試管中，加蒸餾水補至1.0 mL，再加入1.0 mL 5%的苯酚，迅速加入5.0 mL濃硫酸，渦旋混勻后，冷卻至室溫，在490 nm處測定吸光度。以葡萄糖含量為橫坐標，對應(yīng)吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，回歸方程為：y=10.05x+0.001 8，R2=0.999 6。

1.3.3.2 多糖含量的測定

稱取25 mg冷凍干燥后的松露多糖，置于25 mL容量瓶，蒸餾水定容。吸取1 mL配制的多糖溶液于具塞試管中，按1.3.3.1小節(jié)的方法測定樣品中多糖含量，每組樣品重復(fù)測定3次，根據(jù)標準曲線計算樣品多糖含量。

1.3.4 多糖抗氧化活性的測定

1.3.4.1 DPPH·清除率的測定

參照文獻方法[11]。準確稱取15.77 mg DPPH，置于100 mL容量瓶，用無水乙醇溶解并定容，即得0.4 mmol/L的DPPH乙醇溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用），保存于棕色試劑瓶中，備用。準確稱取0.1 g松露多糖，用蒸餾水溶解并定容到25 mL，配制不同質(zhì)量濃度的（0，0.125，0.250，0.500，1.000，2.000，3.000和4.000 mg/mL）的多糖樣品；分別吸取3 mL上述樣品溶液于試管中，加入2 mL DPPH溶液，混勻后，避光靜置反應(yīng)30 min，在517 nm處測定吸光度A1。同時將3 mL不同濃度的樣品溶液與無水乙醇混勻反應(yīng)，測定其吸光度A2，測定空白溶劑（3 mL蒸餾水與2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液的混合溶液）在517 nm處的吸光度A0，以同等濃度的抗壞血酸溶液為陽性對照。每組做3個平行，結(jié)果取均值。DPPH·清除活力按式（2）計算。

1.3.4.2 ABTS+·清除率的測定

參照文獻[12]方法。ABTS儲備液的配制：將5 mL 7 mmol/L ABTS+·溶液和1 mL 15 mmol/L過硫酸鉀溶液混合，在室溫、避光條件下反應(yīng)12 h，得到ABTS儲備液。取一定量的ABTS儲備液，用蒸餾水稀釋一定倍數(shù)后，在734 nm波長處測定吸光度A0（現(xiàn)配現(xiàn)用）。取4 mL ABTS工作液，分別與0.2 mL上述不同質(zhì)量濃度的松露多糖溶液混合，室溫下反應(yīng)6 min，在734 nm波長處測定吸光度A1；以同等濃度的抗壞血酸作陽性對照。每組做3個平行，結(jié)果取均值。ABTS+·清除率按式（3）計算。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)方差分析，結(jié)果以平均值±標準差表示，并用Duncan’s法進行多重比較，Pearson’s法進行相關(guān)性分析。以p＜0.05表示差異或相關(guān)性顯著，以p＜0.01表示差異或相關(guān)性極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 干燥方式對松露多糖含量的影響

2.1.1 多糖提取率

4種干燥方式對松露多糖提取率的影響及以含水率低于13%為干燥終點時所用的時間結(jié)果如表1所示。真空冷凍干燥后松露多糖提取率為7.56%±0.37%，顯著高于微波干燥（6.60%±0.43%）、熱風干燥（6.30%±0.17%）、真空干燥（5.12%±0.26%）（p＜0.05）；熱風干燥與微波干燥對松露多糖提取率無顯著性影響（p＞0.05）；真空干燥松露多糖的提取率最低，說明不同干燥方式會造成松露多糖不同程度的損失。不同干燥方式所需的干燥時間為真空干燥（10 h）＞熱風干燥（8 h）＞微波干燥（7 h）＞真空冷凍干燥（4 h），多糖提取率與干燥時間存在著負相關(guān)性（p＜0.05），即干燥時間越長，松露多糖的提取率越低，說明隨著干燥時間的延長，松露多糖降解得越多。

表1 干燥方式對松露多糖提取率、干燥時間及多糖含量的影響

2.1.2 多糖含量

如表1 所示，經(jīng)不同方式干燥處理，松露多糖含量由高到低依次為真空冷凍干燥（34.40%±0.26%）、熱風干燥（31.40%±0.26%）、真空干燥（28.50%±0.53%）、微波干燥（28.30%±0.57%），真空冷凍干燥后松露多糖含量明顯高于熱風干燥、真空干燥、微波干燥（p＞0.05），真空干燥和微波干燥對松露多糖含量無顯著影響（p＞0.05），說明真空冷凍干燥對松露多糖的含量影響最小。

2.2 干燥方式對松露多糖抗氧化活性的影響

2.2.1 松露多糖對DPPH·的清除能力

由圖1可知，經(jīng)4種干燥方式處理的松露多糖提取物對DPPH·均有較好的清除效果，且效果隨著其質(zhì)量濃度的增加而逐漸增強，但均比對照品VC的作用弱。當多糖質(zhì)量濃度為4 mg/mL時，真空冷凍干燥所得松露多糖提取物對DPPH·清除活力達到了65.18%，作用明顯強于微波干燥、熱風干燥、真空干燥的松露多糖提取物（p＜0.05）。松露多糖提取物對DPPH·的清除率可用DPPH·清除率達到50%時多糖的質(zhì)量濃度即IC50來表示，IC50值越小說明該多糖清除DPPH·的能力越強。經(jīng)真空冷凍干燥、微波干燥、熱風干燥、真空干燥，松露多糖提取物的DPPH·清除率IC50值分別是1.816，2.554，3.959和2.860 mg/mL，即松露多糖提取物對DPPH·的清除率為真空冷凍干燥＞微波干燥＞真空干燥＞熱風干燥。結(jié)果表明松露經(jīng)真空冷凍干燥處理，可以更好地保留松露多糖的抗氧化活性。

圖1 4種干燥方式對DPPH·清除活力的影響

2.2.2 松露多糖對ABTS+·的清除能力

由圖2可知，4種干燥方式處理的松露多糖對ABTS+·均有較強的清除作用，且隨著樣品質(zhì)量濃度的增加而增強，但均比對照品VC的作用弱當質(zhì)量濃度為1.25 mg/mL時，其對ABTS+·清除活力由高到低分別為真空冷凍干燥（65.7%）＞微波干燥（53.09%）＞真空干燥（51.78%）＞熱風干燥（44.78%）；其對ABTS+·清除率IC50值由小到大為真空冷凍干燥（0.91）＜微波干燥（1.062）＜真空干燥（1.138）＜熱風干燥（1.246），說明真空冷凍干燥松露多糖提取物對ABTS+·的清除活力最強，熱風干燥作用最弱。

綜上，不同干燥方式處理的松露多糖提取物對DPPH·、ABTS+·清除活力趨勢一致。當質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL時，松露多糖提取物對DPPH·的清除能力大小為真空冷凍干燥（40.22%）＞微波干燥（37.59%）＞真空干燥（37.48%）＞熱風干燥（28.28%）；其對ABTS+·的清除能力大小為真空冷凍干燥（54.03%）＞微波干燥（47.88%）＞真空干燥（40.52%）＞熱風干燥（36.86%），說明松露多糖提取物對ABTS+·的清除效果優(yōu)于相同質(zhì)量濃度下對DPPH·的清除效果。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

結(jié)果顯示，真空冷凍干燥松露多糖提取率最高，這與真空冷凍干燥技術(shù)的特點有關(guān)[13]，其特點為低溫脫水，使松露本身的物理、化學和生物狀態(tài)基本不變，從而使松露本身的營養(yǎng)物質(zhì)和有效成分得到最大保留。而微波干燥、熱風干燥、真空干燥都是通過高溫加熱來達到干燥的目的，雖然都具有干燥速度快、效率高等特點[14]，但是在干燥過程中其對具有揮發(fā)性成分和熱敏性物質(zhì)具有較大的破壞作用，從而使多糖含量不同程度的降低。

松露中的多糖類是研究較多的生物活性物質(zhì)，松露多糖普遍具有顯著的抗氧化活性[15]，多糖純化程度越高，抗氧化能力越強。在對國產(chǎn)松露的子實體提取物進行抗氧化研究時，發(fā)現(xiàn)松露的乙醇提取物有很高的DPPH·清除活性，乙酸乙酯提取物對羥自由基及鐵離子表現(xiàn)出較強的清除能力或螯合能力，但是石油醚提取物的清除自由基和鐵離子鰲合能力較差[16]，說明松露中能清除自由基的活性物質(zhì)是極性較大的組分，主要提取到極性大的乙酸乙酯和乙醇中，而非極性的石油醚中含量較少。同時，多糖易溶于水，因此此次試驗以大極性的水為提取溶劑，以超聲法提取松露多糖，并對不同干燥方式處理的多糖提取物的抗氧化活性進行了評價。

3.2 結(jié)論

經(jīng)不同干燥方式處理的松露多糖提取率與干燥時間具有相關(guān)性，即干燥時間越長，松露多糖的提取率越低；不同干燥方式對松露多糖含量的影響為真空冷凍干燥＞熱風干燥＞真空干燥＞微波干燥。4種干燥方式處理的松露多糖提取物對DPPH·、ABTS+·均具有較好的清除能力，且對ABTS+·的清除效果優(yōu)于相同質(zhì)量濃度下對DPPH·的清除效果。真空冷凍干燥后松露多糖提取物對DPPH·、ABTS+·的清除作用最強，熱風干燥作用最弱。

綜上所述，真空冷凍干燥對松露多糖保留率最高、耗時最少、抗氧化活性最強，是新鮮松露干燥的最佳方式。