哈密大棗中β-D-葡萄糖苷酶活性測定條件的優(yōu)化

關(guān)尚瑋，陳愷，范利君，王雪妃，劉慧麗，李煥榮

新疆農(nóng)業(yè)大學食品科學與藥學學院（烏魯木齊 830052）

棗（Ziziphus jujubeMill）為鼠李科（Rhamnaceae）木本植物。目前市場上的大棗制品90%以上為干制品，且絕大多數(shù)采用傳統(tǒng)自然干制或者熱風干制的方式[1-2]。大棗在干制過程中容易出現(xiàn)大棗的口感劣變和風味物質(zhì)減弱等現(xiàn)象[3-7]。大棗中的風味物質(zhì)主要存在方式為游離態(tài)物質(zhì)與鍵合態(tài)物質(zhì)，鍵合態(tài)物質(zhì)一般無揮發(fā)性，通常以糖苷鍵合態(tài)的形式存在于大棗中[8]。通過對糖苷鍵合態(tài)成分酶解處理，酶解為游離態(tài)物質(zhì)和糖苷，可增強水果的風味[9-11]。

β-D-葡萄糖苷酶活性的測定方法主要有Barush和Swiain法、熒光法、比色法[12-13]。其中以對硝基苯基-β-D-葡萄糖醛酸苷（pNPG）為反應(yīng)底物的比色法最為精確[14]。已有學者[15]以pNPG為底物對茶葉中β-D-葡萄糖苷酶的活性測定條件進行了研究，建立了茶葉中β-D-葡萄糖苷酶活性的測定條件。

此次試驗以脆熟全紅期哈密大棗為材料，探究β-D-葡萄糖苷酶活性測定的最佳條件，通過PVP的添加量、緩沖液的pH、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間對β-D-葡萄糖苷酶活性的影響，建立哈密大棗中β-D-葡萄糖苷酶活性的檢測方法。根據(jù)前期試驗研究基礎(chǔ)[16]，哈密大棗在自然曬干與45 ℃熱風干制條件下有較好的果型指數(shù)與細胞結(jié)構(gòu)。采用此條件對哈密大棗進行干制，并對干制過程中β-D-葡萄糖苷酶的活性進行測定，為進一步研究哈密大棗在干制過程中香氣成分和香氣形成的機理提供理論依據(jù)[17-18]。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

哈密大棗（新疆哈密）；對硝基苯基-β-D-葡萄糖醛酸苷（pNPG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）：上海源葉生物科技有限責任公司；對硝基苯酚、Na2CO3、檸檬酸、檸檬酸鈉、磷酸氫二鈉、乙酸、乙酸鈉等（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2 主要儀器與設(shè)備

PHS-3C型雷磁pH計（上海儀電科學儀器股份有限公司）；UV-7500型紫外分光光度計（上海棱光技術(shù)有限公司）；JY-2002電子天平（上海良平儀器有限公司）；DZKW-D-2型電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；Anke GL-20G-II型冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

自然曬干：晾曬場地系烏魯木齊新疆農(nóng)業(yè)大學工科樓，平均日照12 h，晾曬期間最高溫度27 ℃，最低氣溫7 ℃。脆取30 kg熟全紅期哈密大棗平鋪于涼席上，放置于天臺空地進行晾曬，當大棗的水分含量至25%左右時停止晾曬，在自然曬干過程中每隔2 d取一次樣，每次取樣500 g，測定大棗中β-D-葡萄糖苷酶活性。

熱風干制：干燥箱升溫至45 ℃，將哈密大棗平鋪于干燥箱內(nèi)托盤上進行熱風干制，在干制過程中每隔4 h取一次樣，每次取樣500 g，當大棗的水分含量至25%左右時干制結(jié)束，測定指標同上。

1.3.2 哈密大棗中β-D-葡萄糖苷酶粗酶液提取

精密稱取5.0 g哈密大棗，置于經(jīng)預(yù)冷的研缽內(nèi)，在研磨過程中添加一定量的PVP和0.5 g石英砂，用預(yù)冷后pH 5.5的緩沖液，冰浴研磨至勻漿，在4 ℃，10 000 r/min下離心20 min，轉(zhuǎn)移上清液，用緩沖液定容至10 mL，得到粗酶液，保存在4 ℃冰箱中備用。

1.3.3 哈密大棗中β-D-葡萄糖苷酶活性測定

在具塞試管中依次加入1 mL緩沖液、1.5 mL粗酶提取液和0.2 mL pNPG，迅速蓋上試管塞后立即放到水浴鍋中反應(yīng)一定時間，之后立即加入2 mL 1 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)，在對硝基苯酚的最佳吸收波長處測其吸光度。

空白對照：以加熱失活的酶液進行同樣處理。

酶活單位定義為每毫升酶液1 min水解1 μmol/L pNPG的酶活力為一個酶活單位U。

式中：K為對硝基苯酚標準曲線的斜率；V為提取酶液總量，mL；Vl為反應(yīng)體系中酶液量，mL；V2為反應(yīng)液總量，mL；M為樣品鮮重，g；Y為酶促反應(yīng)的吸光度；T為反應(yīng)的時間，min。

1.3.4 波長的選擇

精確稱取21.0 mg對硝基苯酚，用蒸餾水定容至1 000 mL。用紫外分光光度計于390～420 nm進行全波段掃描，波長間隔為1 nm，確定對硝基苯酚最大吸收波長。

1.3.5 標準曲線的繪制

精密稱取50.0 mg對硝基苯酚，以蒸餾水定容至1 000 mL容量瓶中。然后以1 mol/L Na2CO3溶液作為溶劑，進行等比稀釋，以1 mol/L Na2CO3溶液作為空白對照，以對硝基苯酚濃度為橫坐標，吸光度A為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.6 PVP添加量對酶活性的影響

在粗酶液的提取過程中，PVP的添加量分別為0，1%，2%，3%，4%和5%，在試驗得到的最大吸收波長下測定其吸光度，最終根據(jù)酶活選擇PVP添加的濃度。

1.3.7 不同時間和溫度對酶活的影響

分別在反應(yīng)溫度為30，35，40，45和50 ℃條件下進行酶活反應(yīng)，分別反應(yīng)30，60，90，120和150 min，在得到的最大吸收波長下測定其吸光度，最終根據(jù)酶活性選擇最適反應(yīng)時間與溫度。

1.3.8 不同緩沖溶液類型和pH對酶活性的影響

反應(yīng)過程中緩沖溶液的類型分別為檸檬酸-檸檬酸三鈉、乙酸-乙酸鈉、檸檬酸-磷酸二鈉，pH分別為4，4.5，5，5.5，6，6.5和7，其他測定條件保持一致，在最大吸收波長處測定吸光度，確定最適緩沖溶液類型與pH。

1.3.9 響應(yīng)面優(yōu)化提取條件

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Design-Expert V 8.0.6軟件進行四因素三水平響應(yīng)面試驗設(shè)計，以β-D-葡萄糖苷酶活性為響應(yīng)值進行回歸分析，建立二次回歸模型以及二次回歸方程。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

此次試驗的所有數(shù)據(jù)均取3次重復(fù)試驗的平均值，采用Origin Pro軟件進行制圖及Design-Expert V 8.0.6軟件和Box-Behnken試驗方法設(shè)計響應(yīng)面優(yōu)化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗分析

2.1.1 吸收波長的選擇

由圖1可知，對硝基苯酚在390～420 nm可見光波長范圍內(nèi)有特征吸收曲線，且在400 nm處有最大吸收峰，因此確定400 nm是對硝基苯酚的最適測定波長。

圖1 對硝基苯酚波長掃描

2.1.2 對硝基苯酚標準曲線

由圖2可知，標準曲線為y=0.017 2x+0.007 4，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 1，對硝基苯酚與吸光度線性關(guān)系良好，符合測定要求。

圖2 對硝基苯酚標準曲線

2.1.3 PVP添加量對酶活性的影響

PVP能夠在酶解的過程中吸附多酚類物質(zhì)，提取酶液過程中添加適量的PVP能夠防止多酚類物質(zhì)對酶活性的影響，通過在提取酶液的過程中適當控制PVP的添加量，對改變酶活性起著重要的作用。由圖3可知，隨著PVP的添加量逐漸增加，酶活性逐漸升高，當PVP的含量添加到3%時酶活性達到最高。添加過量的PVP，酶活性呈現(xiàn)下降趨勢。

2.1.4 反應(yīng)溫度與反應(yīng)時間對酶活性的影響

由圖4可知，酶促反應(yīng)在35 ℃時線性關(guān)系最好，40 ℃次之，50 ℃較差。并且在35 ℃ 90 min條件下酶活性相對較高，條件最優(yōu)。

2.1.5 緩沖溶液類型與pH對酶活性的影響

在2.1.3和2.1.4試驗基礎(chǔ)上，對反應(yīng)過程中緩沖溶液的類型與pH進行篩選。由圖5可知，乙酸-乙酸鈉在pH 5.5時的酶活性明顯高于其他類型的緩沖溶液，檸檬酸-檸檬酸三鈉與檸檬酸-磷酸二鈉的酶活性較低。由此得出，選用乙酸-乙酸鈉在pH 5.5時對哈密大棗中β-D-葡萄糖苷酶活性進行測定的效果最好。

圖3 PVP添加量對酶活性的影響

圖4 不同溫度、時間對酶活性的影響

圖5 不同緩沖液類型和pH對酶活性的影響曲線

2.2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面四因素三水平設(shè)計方案及結(jié)果

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以酶解溫度、酶解時間、pH、PVP添加量為自變量，酶活性作為響應(yīng)值，設(shè)計四因素三水平的二次回歸方程擬合自變量與酶活性之間的函數(shù)關(guān)系，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化酶解工藝。見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平表

采用Design-Expert V 8.0.6軟件進行回歸分析，得出回歸方程：Y=1 366.23+25.78A+97.28B+26.16C+74.24D-2.34AB+6.01AC-16.25AD-12.41BC+64.38BD+62.05CD-543.83A2-255.20B2-424.15C2-450.62D2。在回歸方程中，試驗回歸方程的二次項系數(shù)為負值，表明響應(yīng)值有極大值點，可進行優(yōu)化分析。響應(yīng)面結(jié)果見表2。

表2 設(shè)計響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果

由表3、圖6和圖7可知，模型的顯著性檢驗p＜0.000 1，R2=0.993 3，該模型高度顯著，失擬項不顯著（p=0.052 8），回歸模型和實際試驗擬合充分，模型可行性和精準度高，可以用該模型對哈密大棗中β-葡萄糖苷酶的活性進行分析測定。F（A）=4.74，F(xiàn)（B）=67.46，F(xiàn)（C）=4.88，F(xiàn)（D）=39.28，各因素對β-D-葡萄糖苷酶活性影響順序為酶解溫度＞酶解時間＞PVP添加量＞緩沖液pH，其中PVP添加量與酶解時間對β-D-葡萄糖苷酶活性影響極顯著（p＜0.001），pH與酶解溫度對哈密大棗中β-D-葡萄糖苷酶活性影響差異顯著（p＜0.05）。一次項B（酶解溫度）、D（酶解時間）影響差異極顯著（p＜0.001），交互項BD（pH和酶解溫度）以及CD（PVP添加量和酶解時間）影響差異高度顯著（p＜0.01），4個二次項的影響差異極顯著（p＜0.001）。綜合得出，各因素對哈密大棗中β-D-葡萄糖苷酶活性影響呈不同的線性關(guān)系。各因素在試驗范圍內(nèi)，響應(yīng)面坡度越大，響應(yīng)值對不同條件的變化越敏感；響應(yīng)面坡度越平緩，對響應(yīng)值的影響越小。

表3 響應(yīng)面回歸方程方差分析結(jié)果

圖7 酶解時間和PVP添加量對β-D-葡萄糖苷酶活性影響的響應(yīng)面圖

2.2.2 最佳條件的確定及驗證試驗

該模型得到的最優(yōu)處理水平為緩沖溶液pH 5.23，PVP添加量3.03%，酶解溫度36.03 ℃，酶解時間93.27 min。在此條件下哈密大棗中β-D-葡萄糖苷酶活性為1 204.88 U?？紤]到操作的實際性，將實際試驗條件調(diào)整為酶解時緩沖溶液的pH 5.3，PVP添加量3%，酶解溫度36 ℃，酶解時間94 min。在此條件下重復(fù)3次試驗，β-D-葡萄糖苷酶的活性為1 200.56 U，與模型相符。

2.2.3 不同干制方式對哈密大棗中β-D-葡萄糖苷酶活性的影響

由圖8和圖9可看出，自然曬干與45 ℃熱風干制過程中β-D-葡萄糖苷酶的活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在自然曬干條件下，β-D-葡萄糖苷酶活性在干制第2天上升到最高點（1 700.32 U），從第2天起呈下降趨勢，在第6天酶活消失。在45 ℃熱風干制過程中，β-D-葡萄糖苷酶活性持續(xù)時間較短，β-D-葡萄糖苷酶在第8小時酶活性達到最高，從第12小時開始下降，在第16小時酶活下降速率趨于平緩，在第36小時酶活性消失。綜合分析，哈密大棗在干制過程中β-D-葡萄糖苷酶活性變化均呈現(xiàn)干制期前期酶活性較高，干制結(jié)束時期開始下降的趨勢。

圖8 自然曬干過程中β-D-葡萄糖苷酶活性的變化

圖9 45 ℃熱風干制過程中β-D-葡萄糖苷酶活性的變化

3 結(jié)論

對脆熟全紅期哈密大棗中β-D-葡萄糖苷酶測定過程中緩沖溶液的pH、PVP添加量、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度以及測定波長對酶活性影響進行試驗。結(jié)果顯示，當酶解時緩沖溶液的pH為5.3，PVP添加量為3%，酶解溫度為36 ℃，酶解時間為94 min，測定波長為400 nm時，β-D-葡萄糖苷酶活性最大。在自然干制過程中，β-D-葡萄糖苷酶活性在干制第2天上升至最高點（1 700.32 U），在第6天酶活性消失；在45 ℃熱風干制過程中，β-D-葡萄糖苷酶在第8小時酶活性到達最高點，在第36小時酶活性消失。通過β-D-葡萄糖苷酶活性測定條件的確定，探究不同干制方式以及干制過程中β-D-葡萄糖苷酶活性的變化規(guī)律，對大棗中β-D-葡萄糖苷酶活性與香氣成分的種類和含量的相關(guān)性有待進一步研究。