在線固相萃取-液相法測(cè)定新疆南瓜中生育酚

林毅侃，印杰，林琳，張?chǎng)?，黃雨晴，葛宇

上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院/國(guó)家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（上海）（上海 200233）

南瓜是一年生蔓生草本植物，由于其抗逆能力強(qiáng)、適應(yīng)性強(qiáng)、產(chǎn)量高、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，在世界各地均有種植，尤以亞洲栽培面積最多[1]。南瓜由17%的皮、73%的果肉和10%左右的南瓜瓤組成[2]。南瓜中營(yíng)養(yǎng)豐富并且全面，富含果膠、纖維素、淀粉、脂肪、甘露醇、各種水溶性維生素、生物堿、β-蘿卜素和生育酚等[3-6]。

生育酚為脂溶性維生素的一種，是維持機(jī)體正常生長(zhǎng)、發(fā)育、代謝和其基本生理所需功能的必要物質(zhì)，具有抗氧化、防止衰老、提高機(jī)體免疫力、保護(hù)肝臟功能、抗腫瘤和預(yù)防心腦血管疾病等功效。然而生育酚在結(jié)構(gòu)上極其不穩(wěn)定，在光照、氧氣、高溫及極端pH條件下極易被破壞[7-9]。脂溶性維生素的有關(guān)檢測(cè)方法主要有比色法、熒光法、分光光度法、電化學(xué)法、免疫分析法、高效液相色譜法[10-12]。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的是使用高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定。方法采用將樣品在高濃度堿性條件下進(jìn)行皂化后再進(jìn)行液液分配和濃縮步驟，需要采用復(fù)雜的前處理，消耗大量有機(jī)試劑，并涉及多次蒸發(fā)和溶解步驟。耗費(fèi)大量人力物力的同時(shí)，也增加試驗(yàn)難度，復(fù)雜的檢測(cè)步驟導(dǎo)致生育酚損失，造成回收率下降，待測(cè)成分被破壞等情況。試驗(yàn)采用在線固相萃取-高效液相色譜技術(shù)，建立同時(shí)檢測(cè)4種生育酚的方法。該方法具有分析效率高、前處理簡(jiǎn)單、試驗(yàn)試劑消耗少、結(jié)果重復(fù)性好等特點(diǎn)，不僅縮短分析時(shí)間，也減少試驗(yàn)步驟過(guò)于繁瑣所帶來(lái)的系統(tǒng)誤差及目標(biāo)物的損失，并對(duì)不同產(chǎn)地來(lái)源的南瓜樣品中的生育酚進(jìn)行測(cè)定，以期為南瓜中生育酚的快速檢測(cè)和深入研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南瓜（上海艾妮維農(nóng)產(chǎn)品專業(yè)合作社從新西蘭引進(jìn)的小南瓜品種，所需樣品均采自新疆喀什地區(qū)澤普縣的南瓜試驗(yàn)示范種植基地；樣品于2018年4月26日播種、2018年6月5日開花；其余南瓜均為市售；見表1）。

α-生育酚（標(biāo)準(zhǔn)品，SIGMA公司）；γ-生育酚（標(biāo)準(zhǔn)品，SIGMA公司）；δ-生育酚（標(biāo)準(zhǔn)品，SIGMA公司）；氫氧化鉀（分析純，國(guó)藥）；乙腈（色譜純，國(guó)藥公司）；甲醇（色譜純，國(guó)藥公司）；乙醇、超純水（自制）。

表1 試驗(yàn)用南瓜信息

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（Agilent-1260）、六通閥（1個(gè)）、安捷倫1260四元泵，安捷倫二元泵，紫外檢測(cè)器；色譜柱：BE ONLINE PLRP-S，2.1 mm×12.5 mm、Poroshell PFP，3.0 mm×100 mm。天平（METTLER TOLEDO公司）；離心機(jī)；超聲儀；水浴鍋；等。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別精確稱取0.100 0 g 4種生育酚標(biāo)準(zhǔn)樣品各于100 mL容量瓶中，用乙醇進(jìn)行定容，得到質(zhì)量濃度1.0 g/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，此1 mL溶液相當(dāng)于1.0 mg生育酚。用該儲(chǔ)備液配制成4種生育酚混合標(biāo)準(zhǔn)液。

1.4 色譜條件

Online SPE泵，安捷倫1260四元泵；液相泵，安捷倫二元泵；檢測(cè)器，紫外檢測(cè)器；SPE柱，BE ONLINE PLRP-S，2.1 mm×12.5 mm；液相分析柱Poroshell PFP，3.0 mm×100 mm；流動(dòng)相：SPE泵，水-乙醇（20∶80，V/V），流速1.0 mL/min；液相分離泵，甲醇-乙腈（梯度洗脫，洗脫條件見表2），流速1.0 mL/min。液相色譜柱柱溫：室溫（30 ℃左右）；閥切換時(shí)間0.00 min（位置1～2），4.00 min（位置1～6），15.00 min（位置1～6）。檢測(cè)波長(zhǎng)294 nm；進(jìn)樣體積100 μL。裝置連接示意見圖1。

圖1 液相色譜裝置連接示意圖

表2 液相泵梯度洗脫表

1.5 樣品處理

稱取3 g待測(cè)樣品，加入10 mL溫水渦旋溶解后，加入10 mL乙醇和4 mL 50%氫氧化鉀水溶液，放入82℃水浴鍋皂化20 min，冷卻后用1∶1乙醇水溶液定容至50 mL，離心過(guò)0.22 μm濾膜進(jìn)樣。

2 結(jié)果與討論

2.1 系統(tǒng)流路的配置和一維色譜閥切換時(shí)間的確定

生育酚檢測(cè)前處理非常復(fù)雜，需要樣品在強(qiáng)堿溶液皂化后使用乙醚、石油醚等有機(jī)試劑液液分配萃取，水洗多次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)等提取步驟，操作繁瑣，對(duì)人員操作要求較高。因此會(huì)造成檢測(cè)效率低下、數(shù)據(jù)誤差偏大等問(wèn)題?；诖?，試驗(yàn)對(duì)系統(tǒng)流路進(jìn)行優(yōu)化，在普通液相的前端，增加一根以剛性高聚合物為填料的能夠耐強(qiáng)堿的PLRP-S凈化柱。該配置可以滿足直接使用強(qiáng)堿的皂化液進(jìn)行生育酚的檢測(cè)。同時(shí)PLRP-S凈化柱具有反向色譜吸附分離原理，在1 mL—水甲醇流動(dòng)相條件下，皂化液中的目標(biāo)物質(zhì)會(huì)被吸附于凈化柱上，在經(jīng)過(guò)Online SPE泵數(shù)分鐘的流動(dòng)相沖洗后，堿液及部分雜質(zhì)被沖洗進(jìn)入廢液管路，保護(hù)后續(xù)用于分離的液相色譜柱及儀器系統(tǒng)不收任何破。經(jīng)過(guò)六通閥的轉(zhuǎn)換，液相泵的流動(dòng)相進(jìn)入凈化柱內(nèi)，將目標(biāo)物質(zhì)洗脫入液相分析柱進(jìn)行色譜分離。通過(guò)連續(xù)進(jìn)樣，確定在4 min左右的SPE沖洗時(shí)間，洗脫液的pH達(dá)到中性，并且富集在凈化柱上的生育酚并沒(méi)有損失，因此確定六通閥的最終切換時(shí)間為4 min。

2.2 液相色譜條件優(yōu)化

普通的C8或者C18色譜柱無(wú)法分離β-生育酚和γ-生育酚。使用PFP為填料的色譜柱，由圖2和圖3可見，在洗脫溶劑為甲醇和乙腈的情況下，PFP色譜柱可以很好地分離4種不同的生育酚?？紤]到在切換流動(dòng)相后，必須使用高濃度的有機(jī)相才能將SPE柱上富集的生育酚迅速、完全地沖洗下來(lái)，并且還需要保證4種生育酚的分離度及其與樣品液中殘留雜質(zhì)的分離度，液相條件采用梯度洗脫。

圖2 4種生育酚色譜圖

圖3 南瓜樣品色譜圖

2.3 生育酚的定量檢出限

前處理簡(jiǎn)化萃取和濃縮的步驟，相應(yīng)地增大樣品的稀釋倍數(shù)，為了能夠達(dá)到國(guó)家規(guī)定的檢出限，方法將進(jìn)樣量擴(kuò)大到100 μL。使用空白樣品進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)（加標(biāo)量0.120 mg/100 g），結(jié)果表明在進(jìn)樣量100 μL條件下，色譜峰相應(yīng)較高，能夠準(zhǔn)確積分和定量，該試驗(yàn)條件能夠滿足國(guó)標(biāo)要求的檢出限。

2.4 線性關(guān)系

按1.4色譜條件，吸取標(biāo)準(zhǔn)系列溶液各100 μL進(jìn)行進(jìn)樣檢測(cè)。以標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖4～圖6），并進(jìn)行線性回歸得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

α-生育酚：Y=41.317 02X+1.164 08，r2=0.999 81。δ-生育酚：Y=29.487 80X-0.768 598，r2=0.999 91。γ-生育酚：Y=43.798 04X-1.004 96，r2=0.999 67。

圖4 α-生育酚標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖5 γ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖6 δ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 回收率和精密度

分別在南瓜樣品中添加0.120，0.240，0.600和1.20 mg/100 g的4種生育酚，每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定6次，外標(biāo)法定量，扣去本底后結(jié)果見表3。

表3 空白南瓜基質(zhì)中α-生育酚、γ-生育酚、β-生育酚、δ-生育酚加標(biāo)收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

2.6 樣品測(cè)定

采用方法對(duì)表1所列的18份南瓜樣品進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見表4。

表4 南瓜樣品檢測(cè)含量 mg/100 g

3 結(jié)果與展望

試驗(yàn)在普通液相的配置上增加一泵一閥，搭建在線固相萃取-高效液相色譜法直接檢測(cè)南瓜樣品皂化液中的3種生育酚。方法檢出限與GB 5009.82—2016保持一致，且測(cè)定結(jié)果的重復(fù)性好，加標(biāo)回收準(zhǔn)確可靠。以此色譜條件測(cè)定的18份南瓜樣品中的生育酚含量差異明顯，新疆喀什種植的南瓜的生育酚含量普遍高于其余品種的南瓜，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值明顯。

方法從原理上可以滿足各種不同基質(zhì)的食品中的檢測(cè)，不僅限于南瓜產(chǎn)品，在后續(xù)試驗(yàn)中，可進(jìn)一步測(cè)試其他基質(zhì)食品，完善數(shù)據(jù)，增大方法適用性。