地耳菜乙醇提取物的生物活性

沙金，陳烽，李超，湯薇，魏逸超，陳盛芳

徐州工程學(xué)院食品與生物工程學(xué)院（徐州 221018）

地耳菜（Nostoc sphaeroids）又名葛仙米，為我國(guó)常見的傳統(tǒng)食用藻類之一。地耳菜的活性成分主要為多糖、蛋白質(zhì)及多酚等[1]，在提高免疫力[2]、抗氧化[3]及抗炎[4]等方面具有較好的效果。試驗(yàn)從地耳菜乙醇提取物的成分分析、抗氧化活性、抑制胰脂肪酶、乙酰膽堿酯酶及HepG2細(xì)胞增殖活性等多個(gè)方面進(jìn)行研究，為地耳菜的開發(fā)利用提供論據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

地耳菜（寧夏香草生物技術(shù)有限公司）；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所）；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（上海如吉生物科技有限公司）；對(duì)二甲氨基肉桂醛（p-DMACA，上海源葉生物科技有限公司）；Ferrozine、L-抗壞血酸、4-硝基苯棕櫚酸酯（pNPP）、胰脂肪酶和乙酰膽堿酯酶（合肥博美生物科技有限公司）；Orlistat（北京泛球生物科技有限公司）；二硫代硝基苯甲酸（DTNB，上海伊卡生物技術(shù)有限公司）；碘化硫代乙酰膽堿（AChI，合肥巴斯夫生物科技有限公司）；胰酶細(xì)胞消化液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；四甲基噻唑藍(lán)（MTT）、2, 2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（DPPH）（美國(guó)Sigma-Aldrich公司）；人肝癌細(xì)胞HepG2（中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)）；胎牛血清（FBS）、RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、青鏈霉素混合液（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；其他試劑為分析純。

1.2 設(shè)備與儀器

LGJ-10型真空冷凍干燥機(jī)（北京四環(huán)科學(xué)儀器廠）；JHBE-50T型閃式提取儀（成都宜邦科析儀器有限公司）；723C型可見分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；Synergy H1型全功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 乙醇提取物的制備

原料→烘干（60 ℃）→粉碎→過(guò)篩（0.150 mm）→浸泡（70%乙醇，液料比10∶1 mL/g，12 h）→閃式提?。妷?0 V，每次60 s，3次）→離心（4 000 r/min，15 min）→抽濾→減壓濃縮→冷凍干燥→乙醇提取物

1.3.2 成分含量的測(cè)定

1.3.2.1 多酚含量測(cè)定

采用福林酚法[5]。

1.3.2.2 黃酮含量測(cè)定

采用NaNO2-Al3+-NaOH法[6]。

1.3.3 抗氧化活性測(cè)定

1.3.3.1 總還原力

按參考文獻(xiàn)[7]方法稍有修改。將0.5 mL不同質(zhì)量濃度的地耳菜乙醇提取物溶液、1.25 mL 0.2 mol/L的PBS緩沖液（pH 6.6）和1.25 mL 1%鐵氰化鉀溶液混合，晃勻，50 ℃避光反應(yīng)20 min后，加入1.25 mL 10%三氯乙酸終止反應(yīng)進(jìn)行，并對(duì)溶液進(jìn)行離心；將4.25 mL純凈水和0.85 mL 0.1% FeCl3溶液加入離心后的上清液，搖勻，測(cè)定700 nm處溶液的吸光度，記作As；同時(shí)設(shè)不含試樣的空白組，測(cè)定吸光度，記作At。

1.3.3.2 DPPH自由基清除

按參考文獻(xiàn)[8]方法稍有修改。在3 mL 2.05×10-4mol/L DPPH溶液中加入1 mL不同質(zhì)量濃度的地耳菜乙醇提取物溶液，晃勻，37 ℃避光反應(yīng)1 h。測(cè)定溶液517 nm處吸光度，記作Am；采用純凈水替代試樣溶液，重復(fù)上述過(guò)程，測(cè)定吸光度，記作An；同時(shí)設(shè)不含DPPH的空白組，重復(fù)上述過(guò)程，測(cè)定吸光度，記作Ak。

1.3.3.3 亞鐵離子螯合

按參考文獻(xiàn)[9]方法稍有修改。將1.0 mL不同質(zhì)量濃度的地耳菜乙醇提取物溶液、2.73 mL純凈水和70 μL 2 mmol/L硫酸亞鐵溶液依次加入到試管，晃勻，加入200 μL 5 mmol/L Ferrozine溶液促使螯合反應(yīng)開始，37 ℃避光保溫20 min，測(cè)定562 nm處溶液吸光度，記作Ao；測(cè)定不含試樣時(shí)溶液的吸光度，記作Ap；采用純凈水代替硫酸亞鐵溶液和Ferrozine溶液，測(cè)定吸光度，記作Aq。

1.3.4 抑制胰脂肪酶活性測(cè)定

按參考文獻(xiàn)[10]方法稍有修改。在96孔板中依次添加50 μL不同質(zhì)量濃度的地耳菜乙醇提取物溶液與50 μL 1.2 U/mL胰脂肪酶溶液，37 ℃避光保溫10 min；加入100 μL 0.2 mmol/LpNPP溶液，晃勻后于37 ℃避光反應(yīng)20 min，測(cè)定溶液在405 nm處吸光度，記作Ai；采用PBS代替試樣溶液，測(cè)定吸光度，記作Ac；采用PBS代替胰脂肪酶溶液，測(cè)定吸光度，記作Aj；采用PBS代替試樣和胰脂肪酶溶液，測(cè)定吸光度，記作Ad。

1.3.5 抑制乙酰膽堿酯酶活性測(cè)定

按參考文獻(xiàn)[11]方法稍有修改。在4 mL離心管中依次添加500 μL不同質(zhì)量濃度的地耳菜乙醇提取物溶液與50 μL 0.16 U/mL乙酰膽堿酯酶（AChE）溶液；混勻，37 ℃避光反應(yīng)15 min；加入200 μL 1 mmol/L DTNB溶液和200 μL 1.875 mmol/L碘化硫代乙酰膽堿溶液；混勻，37 ℃避光反應(yīng)20 min；405 nm處測(cè)定吸光度，記作Ai；采用PBS代替試樣溶液，重復(fù)上述過(guò)程，測(cè)定吸光度，記作Ac；分別用PBS代替乙酰膽堿酯酶溶液、試樣溶液、試樣和乙酰膽堿酯酶溶液，并測(cè)定其吸光度。抑制率計(jì)算參考1.3.4。

1.3.6 抑制HepG2肝癌細(xì)胞增殖活性測(cè)定

按參考文獻(xiàn)[12]方法稍有修改。取經(jīng)過(guò)消化處理的對(duì)數(shù)期細(xì)胞，并用培養(yǎng)基配制細(xì)胞懸液（1×105個(gè)/mL），轉(zhuǎn)移100 μL至96孔板中37 ℃培養(yǎng)1 d，除去每孔中原有培養(yǎng)基，將配制好的不同質(zhì)量濃度梯度的地耳菜乙醇提取物溶液加入每孔中，繼續(xù)37 ℃培養(yǎng)1 d后，加入MTT，37 ℃培養(yǎng)4 h結(jié)束培養(yǎng)周期，加入DMSO使每孔中的沉淀物質(zhì)充分溶解后，490 nm處酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度，并測(cè)定只含RPMI-1640培養(yǎng)基的空白組和不含地耳菜乙醇提取物溶液的對(duì)照組的吸光度。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，IC50值采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及多酚黃酮測(cè)定結(jié)果

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

多酚回歸方程為y=0.082 4x-0.002 2（R2=0.996 8），結(jié)果表明多酚測(cè)定在0～9 μg/mL之間線性良好；黃酮回歸方程為y=0.010 9x-0.009 2（R2=0.999 0），結(jié)果表明，黃酮測(cè)定在0～72 μg/mL之間線性良好。

2.1.2 測(cè)定結(jié)果

地耳菜乙醇提取物中多酚含量10.22±0.06 mg GAE/g FDW，黃酮含量41.37±0.30 mg RE/g FDW。

2.2 抗氧化活性分析

2.2.1 總還原力

以VC為代表的部分抗氧化劑，可以通過(guò)其自有還原性與氧化劑反應(yīng)，從而避免其他物質(zhì)被氧化，故總還原力是常用的評(píng)價(jià)試樣抗氧化活性的方法之一。由圖1可知，地耳菜乙醇提取物有較好的還原力，其在質(zhì)量濃度15～150 μg/mL范圍內(nèi)，Arp的變化為0.045～0.641，且與地耳菜乙醇提取物的質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。Arp相同時(shí)，VC質(zhì)量濃度遠(yuǎn)低于地耳菜乙醇提取物的質(zhì)量濃度，說(shuō)明VC的還原力更好。

圖1 總還原力

2.2.2 DPPH自由基清除

抗氧化劑可以與DPPH分子中的1個(gè)自由基上的自由電子配對(duì)，從而減少自由基的數(shù)量，常用于評(píng)估試樣的抗氧化能力。由圖2可知，在質(zhì)量濃度50～500 μg/mL范圍，地耳菜乙醇提取物對(duì)DPPH清除率為1.68%～88.25%，且清除率與試樣質(zhì)量濃度呈正比，IC50值為217.25 μg/mL，而VC的IC50值為2.41 μg/mL，說(shuō)明VC對(duì)DPPH自由基的清除能力更強(qiáng)。

2.2.3 亞鐵離子螯合

金屬離子不僅具有氧化性，而且是氧自由基產(chǎn)生過(guò)程中必需物質(zhì)，而螯合劑能與金屬離子結(jié)合生成穩(wěn)定的化合物，降低其對(duì)氧化過(guò)程的作用，故螯合性常用于評(píng)價(jià)試樣抗氧化能力。由圖3可知，在質(zhì)量濃度90～900 μg/mL范圍內(nèi)，地耳菜乙醇提取物質(zhì)量濃度逐漸增加時(shí)，其對(duì)亞鐵離子的螯合能力也同步升高，且最大螯合率為88.45%。地耳菜乙醇提取物對(duì)亞鐵離子螯合的IC50值為320.31 μg/mL，EDTA-2Na的IC50值為4.63 μg/mL，說(shuō)明EDTA-2Na的抗氧化能力強(qiáng)于地耳菜乙醇提取物。

圖2 DPPH自由基清除活性

圖3 亞鐵離子螯合活性

2.3 抑制胰脂肪酶活性分析

胰脂肪酶活性過(guò)高時(shí)，會(huì)使血液中的脂質(zhì)含量升高，從而導(dǎo)致血脂異常；抑制胰脂肪酶的活性，可以減少脂質(zhì)的分解，從而降低人體對(duì)脂質(zhì)的吸收。由圖4可知，質(zhì)量濃度12.5～100 μg/mL內(nèi)，地耳菜乙醇提取物對(duì)胰脂肪酶活性的抑制率為10.7%～62.89%，且抑制率與地耳菜乙醇提取物的質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。地耳菜乙醇提取物的IC50值為74.81 μg/mL，陽(yáng)性對(duì)照Orlistat的IC50值為0.16 mg/mL，說(shuō)明Orlistat對(duì)降血脂的效果更好。

圖4 抑制胰脂肪酶活性

2.4 抑制乙酰膽堿酯酶活性分析

乙酰膽堿酯酶能迅速水解作用于突觸后膜的神經(jīng)遞質(zhì)，保證神經(jīng)信號(hào)的正常傳遞；其活性過(guò)高使得突觸間的神經(jīng)遞質(zhì)過(guò)早被水解，被認(rèn)為是導(dǎo)致阿爾茨海默病的原因之一。由圖5可知，在質(zhì)量濃度0.5～4.0 mg/mL范圍內(nèi)，地耳菜乙醇提取物對(duì)乙酰膽堿酯酶活性的抑制率為19.69%～67.76%，且抑制率與地耳菜乙醇提取物的質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。地耳菜乙醇提取物的IC50值為2.47 mg/mL，陽(yáng)性對(duì)照Galantamine的IC50值為0.016 μg/mL，說(shuō)明Galantamine對(duì)改善阿爾茨海默病的效果更好。

圖5 抑制乙酰膽堿酯酶活性分析

2.5 抑制HepG2細(xì)胞增殖活性分析

HepG2是一種常見且穩(wěn)定的人肝癌細(xì)胞，國(guó)內(nèi)外學(xué)者常用其進(jìn)行肝癌發(fā)病機(jī)理的探究和治療肝癌藥物的篩選。由圖6可知，在質(zhì)量濃度450和900 μg/mL范圍內(nèi)，地耳菜乙醇提取物對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞增殖的抑制效果遠(yuǎn)低于75 μg/mL的陽(yáng)性對(duì)照5-FU對(duì)應(yīng)的抑制率，說(shuō)明其抑制HepG2肝癌細(xì)胞增殖的活性較差。

圖6 抑制HepG2細(xì)胞增殖

3 結(jié)論

試驗(yàn)測(cè)定地耳菜乙醇提取物中多酚和黃酮含量，并評(píng)價(jià)其抗氧化、降低血脂及抑制乙酰膽堿酯酶活性的效果，同時(shí)探究其作為抗腫瘤藥物的可能性，為地耳菜生物活性的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。結(jié)果表明，地耳菜乙醇提取物具有較好的還原力，能有效清除DPPH自由基并較好地螯合亞鐵離子；在活性抑制方面，地耳菜乙醇提取物能有效地抑制胰脂肪酶活性，但其對(duì)乙酰膽堿酯酶及HepG2細(xì)胞增殖活性的抑制效果并不明顯。因此，地耳菜乙醇提取物可作為制備天然抗氧化劑及降血脂藥物的原料，具有廣闊的開發(fā)利用空間和巨大市場(chǎng)潛力。