miR-324-5p靶向調(diào)控CARD9對(duì)急性胰腺炎腺泡細(xì)胞增殖、凋亡的影響及機(jī)制

楊陳 曹小瑤 劉明宗 高榕茂

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院(東院)ICU，四川 成都 610101)

急性胰腺炎(AP)是臨床常見(jiàn)疾病且病死率極高，根據(jù)疾病嚴(yán)重程度分為輕度、中度及重度，其中重度AP患者預(yù)后較差且常伴隨多種并發(fā)癥導(dǎo)致患者死亡率升高〔1〕。胰腺腺泡細(xì)胞凋亡是AP發(fā)生及發(fā)展的重要因素，從防止胰腺腺泡細(xì)胞凋亡及促進(jìn)細(xì)胞增殖的角度進(jìn)行干預(yù)及治療成為研究熱點(diǎn)〔2〕。微小RNA(miRNA)異常表達(dá)可通過(guò)調(diào)控靶基因表達(dá)進(jìn)而參與AP發(fā)生及發(fā)展過(guò)程〔3〕。研究表明，miR-324-5p在重度AP患者外周血中低表達(dá)，同時(shí)在缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞損傷過(guò)程中miR-324-5p下調(diào)表達(dá)并可抑制心肌細(xì)胞凋亡〔4,5〕。然而關(guān)于miR-324-5p在AP腺泡細(xì)胞增殖及凋亡過(guò)程中的可能作用機(jī)制研究未見(jiàn)報(bào)道。通過(guò)靶基因網(wǎng)站預(yù)測(cè)到胱天蛋白酶募集域蛋白(CARD)9可能是miR-324-5p的靶基因，研究顯示早期AP患者外周血CARD9蛋白和mRNA表達(dá)顯著升高，且CARD9的表達(dá)水平與胰腺炎嚴(yán)重程度呈正相關(guān)〔6,7〕。但miR-324-5p和CARD9對(duì)AP腺泡細(xì)胞增殖、凋亡的影響，且miR-324-5p是否通過(guò)調(diào)控CARD9表達(dá)影響AP腺泡細(xì)胞增殖、凋亡目前還尚未可知。本研究通過(guò)雨蛙肽素處理大鼠胰腺腺泡細(xì)胞株AR42J，觀察miR-324-5p表達(dá)變化對(duì)AR42J細(xì)胞增殖及凋亡的影響，驗(yàn)證其與CARD9的靶向作用關(guān)系進(jìn)而為提高臨床AP治療效果提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 胰腺腺泡細(xì)胞株AR42J購(gòu)自美國(guó)American Type Culture Collection公司。雨蛙肽購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。CARD9 siRNA、si-NC均購(gòu)自美國(guó)GeneCopopia公司；CARD9過(guò)表達(dá)慢病毒及其對(duì)照病毒均購(gòu)自Polybrene Hanbio公司；miR-NC、miR-324-5p mimic、anti-miR-NC、miR-324-5p抑制劑(anti-miR-324-5p)均購(gòu)自上海吉瑪基因公司；胎牛血清(FBS)、RPMI1640培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素混合溶液、磷酸鹽緩沖液(PBS)均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒均購(gòu)自上海普盛生物公司；Annexin V-FITC 凋亡檢測(cè)試劑盒、Trizol 試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)ABI公司；熒光素酶報(bào)告基因載體購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；噻唑藍(lán)(MTT)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；RNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；兔抗鼠活化的酶切含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3抗體、B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2，Bcl-2 相關(guān) X 蛋白(Bax)抗體及辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗鼠IgGⅡ抗均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；RIPA細(xì)胞裂解液購(gòu)自上海生物工程股份有限公司；兔抗鼠CARD9、細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1、p21、p27抗體均購(gòu)自美國(guó)CST公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京威格拉斯生物技術(shù)有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及AP細(xì)胞模型構(gòu)建 將AR42J細(xì)胞培養(yǎng)于含有10% FBS及青霉素-鏈霉素混合溶液的RPMI1640培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。構(gòu)建AP模型〔8〕：造模前1 d，取AR42J細(xì)胞接種于6孔板(5.5×104個(gè)細(xì)胞/孔)，加入RPMI1640培養(yǎng)基1 ml/孔，放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，加入濃度為100 nmol/L的雨蛙肽刺激細(xì)胞6 h，振蕩混勻后繼續(xù)培養(yǎng)12 h，收集上清液采用ELISA檢測(cè)TNF-α、IL-6濃度。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 未經(jīng)雨蛙肽作用的AR42J細(xì)胞為對(duì)照組，雨蛙肽刺激的AR42J細(xì)胞為雨蛙肽組。轉(zhuǎn)染前1 d將雨蛙肽刺激的AR42J細(xì)胞接種于6孔板(5.5×105個(gè)細(xì)胞/孔)，隨機(jī)分為雨蛙肽+miR-NC組、雨蛙肽+miR-324-5p組、雨蛙肽+si-NC組、雨蛙肽+si-CARD9組、雨蛙肽+miR-324-5p+pcDNA組、雨蛙肽+ miR-324-5p+pcDNA-CARD9組。轉(zhuǎn)染時(shí)分別用不含F(xiàn)BS的RPMI1640培養(yǎng)基稀釋Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑、miR-NC、miR-324-5p mimic、si-NC、si-CARD9、pcDNA、pcDNA-CARD9，稀釋至濃度為100 nmol/L，參照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，轉(zhuǎn)染6 h后更換為RPMI1640完全培養(yǎng)基，置于恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-324-5p及CARD9 mRNA表達(dá)水平 收集各組AR42J細(xì)胞，PBS洗滌，分別加入Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，RNA定量后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR，20 μl反應(yīng)體系分別為SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μl/孔，cDNA 1 μl/孔，上下游引物各0.5 μl/孔，ddH2O 8 μl/孔。qRT-PCR擴(kuò)增條件為循環(huán)1次(95℃ 6 min)，95℃變性15 s循環(huán)40次，60℃退火60 s循環(huán)40次。miR-324-5p以U6為內(nèi)參基因，CARD9以GAPDH為內(nèi)參基因，反應(yīng)結(jié)束后得到各孔樣品Ct值，采用2-ΔΔCt算法計(jì)算miR-324-5p、CARD9 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.5Western印跡檢測(cè)CARD9、CyclinD1、p21、p27、Bcl-2、Bax、酶切caspase-3蛋白表達(dá) 收集各組AR42J細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞，分別加入RIPA細(xì)胞裂解液，提取蛋白，蛋白樣品定量后加入1倍蛋白電泳緩沖液，以50 μg/孔蛋白樣本加入十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)槽內(nèi)，SDS-PAGE反應(yīng)條件為80 V 30 min，120 V 90 min，電泳結(jié)束后應(yīng)用半干法將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，放入含有5%脫脂牛奶中封閉2 h，加入各蛋白一抗(1∶1 000)，4℃條件下孵育24 h，用TBST洗滌3次，15 min/次，置于二抗(1∶2 000)中反應(yīng)2 h，TBST洗滌后加入增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)進(jìn)行顯色反應(yīng)，置于凝膠電泳成像儀進(jìn)行掃描，各蛋白均以GAPDH為內(nèi)參基因，應(yīng)用Quantity One軟件分析各蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 收集各組轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h 的AR42J細(xì)胞，胰酶消化后接種至96孔板，每孔分別加入質(zhì)量濃度為5 mg/ml的MTT試劑20 μl，培養(yǎng)2 h后棄上清，每孔分別加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min后應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處的各孔吸光度(OD)值。

1.7流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期AR42J細(xì)胞，利用Annexin V-FITC 凋亡檢測(cè)試劑盒進(jìn)行染色，避光條件下依次分別加入5 μl Annexin V-FITC與5 μl PI，振蕩混勻10 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組AR42J細(xì)胞凋亡情況，細(xì)胞凋亡率=(早期凋亡細(xì)胞+晚期凋亡細(xì)胞)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.8雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 分別構(gòu)建含有野生型CARD9 3′UTR序列的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒WT-CARD9與含有突變型CARD9 3′UTR序列的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒MUT-CARD9，收集未經(jīng)雨蛙肽處理的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期AR42J細(xì)胞，用含有10%FBS及雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基稀釋AR42J細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/ml，接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分別將WT-CARD9、MUT-CARD9質(zhì)粒與miR-324-5p mimic或陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染至AR42J細(xì)胞，每組均設(shè)置3次重復(fù)，置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h，應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)各組細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1對(duì)照組與雨蛙肽組TNF-α、IL-6水平比較 對(duì)照組TNF-α、IL-6濃度(123.15±11.32)ng/L、(102.14±16.57)ng/L，雨蛙肽組為(316.23±16.47)ng/L、(358.42±18.36)ng/L，雨蛙肽刺激后AR42J細(xì)胞TNF-α、IL-6濃度均顯著升高(P<0.05)，提示造模成功。

2.2miR-324-5p和CARD9在胰腺炎腺泡細(xì)胞AR42J中的表達(dá) 雨蛙肽組胰腺炎腺泡細(xì)胞AR42J中miR-324-5p表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，而CARD9 mRNA及蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)圖1，表1。

2.3miR-324-5p過(guò)表達(dá)對(duì)胰腺炎腺泡細(xì)胞AR42J增殖的影響 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-324-5p mimic的AR42J細(xì)胞miR-324-5p表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，提示成功提高雨蛙肽誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞中miR-324-5p的表達(dá)水平。MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雨蛙肽可降低AR42J細(xì)胞增殖活性(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染miR-324-5p mimic后可增強(qiáng)AR42J細(xì)胞增殖活性(P<0.05)。Western印跡結(jié)果顯示，雨蛙肽處理后CyclinD1蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)，而p21、p27蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，miR-324-5p 過(guò)表達(dá)后CyclinD1蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，而p21、p27蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)圖2，表2。

圖1 CARD9蛋白表達(dá)

表1 miR-324-5p和CARD9在胰腺炎腺泡細(xì)胞AR42J中的表達(dá)

圖2 增殖相關(guān)蛋白表達(dá)

表2 miR-324-5p過(guò)表達(dá)對(duì)胰腺炎腺泡細(xì)胞AR42J增殖的影響

2.4miR-324-5p過(guò)表達(dá)對(duì)胰腺炎腺泡細(xì)胞AR42J凋亡的影響 雨蛙肽組AR42J細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組明顯升高(P<0.05)，而miR-324-5p過(guò)表達(dá)后AR42J細(xì)胞凋亡率較雨蛙肽+miR-NC組明顯降低(P<0.05)。Western印跡結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，雨蛙肽組AR42J細(xì)胞抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，而促凋亡蛋白Bax、酶切caspase-3表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與雨蛙肽+si-NC組比較，雨蛙肽+si-CARD9組Bcl-2蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，而Bax、酶切caspase-3蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)圖3，表3，圖4。

圖3 細(xì)胞凋亡流式圖

表3 miR-324-5p過(guò)表達(dá)對(duì)胰腺炎腺泡細(xì)胞AR42J凋亡的影響

圖4 凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

2.5抑制CARD9表達(dá)對(duì)胰腺炎腺泡細(xì)胞AR42J增殖和凋亡的影響 Western印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示雨蛙肽+si-CARD9組AR42J細(xì)胞中CARD9蛋白表達(dá)水平顯著低于雨蛙肽+si-NC組(P<0.05)，提示成功抑制胰腺炎腺泡細(xì)胞AR42J中CARD9的高表達(dá)。MTT與流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，與雨蛙肽+si-NC組比較，雨蛙肽+si-CARD9組AR42J 48、72 h細(xì)胞增殖活性明顯升高(P<0.05)，而細(xì)胞凋亡率明顯減少(P<0.05)，同時(shí)Western印跡檢測(cè)結(jié)果顯示雨蛙肽組p21、 Bax蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而CyclinD1、Bcl-2蛋白表達(dá)水均顯著降低于對(duì)照組(P<0.05)；雨蛙肽+si-CARD9組AR42J細(xì)胞CyclinD1、Bcl-2蛋白表達(dá)水顯著高于雨蛙肽+si-NC組(P<0.05)，而p21、 Bax蛋白表達(dá)水顯著低于雨蛙肽+si-NC組(P<0.05)，見(jiàn)圖5、表4。

圖5 CARD9和增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

表4 抑制CARD9表達(dá)對(duì)胰腺炎腺泡細(xì)胞AR42J增殖和凋亡的影響

2.6miR-324-5p靶向調(diào)控CARD9的表達(dá) 雙熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，CARD9的3′UTR中含有與miR-324-59互補(bǔ)的核苷酸序列(圖6)；與轉(zhuǎn)染miR-NC比較，共轉(zhuǎn)染miR-324-5p mimic與WT-CARD9野生質(zhì)粒可使細(xì)胞熒光素酶活性明顯降低(P<0.05)；而共轉(zhuǎn)染miR-324-5p mimic與MUT-CARD9突變型質(zhì)粒后細(xì)胞熒光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表5。抑制miR-324-5p表達(dá)后CARD蛋白表達(dá)水平(0.81±0.08)顯著高于anti-miR-NC組(0.42±0.05)(P<0.05)，miR-324-5p過(guò)表達(dá)后CARD蛋白表達(dá)水平(0.18±0.03)顯著低于miR-NC組(0.45±0.04)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖7。

2.7CARD9過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-324-5p過(guò)表達(dá)對(duì)雨蛙肽誘導(dǎo)的胰腺炎腺泡細(xì)胞AR42J增殖和凋亡的作用 Western印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，雨蛙肽+ miR-324-5p+pcDNA-CARD9組AR42J細(xì)胞CARD9蛋白表達(dá)相較于雨蛙肽+miR-324-5p+pcDNA組明顯升高(P<0.05)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)染miR-324-5p mimic與pcDNA-CARD9后AR42J 48、72 h細(xì)胞增殖活性顯著降低，而細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，CyclinD1、Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，而p21、Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)表6、圖8。

圖6 CARD9的3′UTR中含有與miR-324-5p互補(bǔ)的核苷酸序列

1～4：miR-NC組,miR-324-5p組,anti-miR-NC組,anti-miR-324-5p組圖7 miR-324-5p靶向調(diào)控CARD9的表達(dá)

表5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

表6 CARD9過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-324-5p過(guò)表達(dá)對(duì)雨蛙肽誘導(dǎo)的胰腺炎腺泡細(xì)胞AR42J增殖和凋亡的作用

1～4：miR-NC組,miR-324-5p組,miR-324-5p+pcDNA組,miR-324-5p+pcDNA-CARD9組圖8 CARD9和增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討 論

AP發(fā)病迅速且疾病進(jìn)展較快，目前尚無(wú)治療AP的有效方法，研究顯示AP發(fā)生及發(fā)展過(guò)程涉及多基因或多條信號(hào)通路調(diào)控，胰腺腺泡細(xì)胞增殖及凋亡與AP疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)，而AP發(fā)生及發(fā)展與miRNAs異常表達(dá)有關(guān)，其根本原因在于miRNAs異常表達(dá)可促使胰腺組織發(fā)生炎癥反應(yīng)發(fā)生進(jìn)而參與疾病進(jìn)展過(guò)程〔9,10〕。因此著重分析miRNAs與胰腺腺泡細(xì)胞增殖及凋亡的作用關(guān)系具有重要意義。

miR-324-5p在肝細(xì)胞癌組織及細(xì)胞中均呈低表達(dá)并可發(fā)揮抑癌作用，研究表明上調(diào)miR-324-5p表達(dá)可降低肝癌細(xì)胞增殖遷移及侵襲能力，沉默miR-324-5p表達(dá)可促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移及侵襲〔11〕。研究表明miR-324-5p可在多種惡性腫瘤中均發(fā)揮抑癌基因作用，并可為癌癥的精準(zhǔn)治療提供潛在靶點(diǎn)〔12〕。Rider等〔13〕研究表明miR-324-5p在肺炎患者中呈低表達(dá)，并可作為臨床診斷肺炎的標(biāo)志物。但miR-324-5p在AP疾病發(fā)生及發(fā)展中的作用尚不清楚。本研究結(jié)果說(shuō)明miR-324-5p表達(dá)水平降低可能是AP發(fā)生的原因之一。通過(guò)將miR-324-5p mimic轉(zhuǎn)染至AR42J細(xì)胞以此上調(diào)miR-324-5p表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-324-5p過(guò)表達(dá)后AR42J細(xì)胞增殖活性顯著增強(qiáng)，CyclinD1蛋白表達(dá)水平明顯升高，而p21、p27蛋白表達(dá)水平明顯降低，CyclinD1可通過(guò)與CDK4/6結(jié)合而調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)而促使細(xì)胞進(jìn)入S期，p21、p27又可抑制CyclinD1與CDK4/6結(jié)合進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞停滯于G1期〔14〕。提示上調(diào)miR-324-5p表達(dá)可降低p21、p27表達(dá)水平促進(jìn)CyclinD1與CDK4/6結(jié)合并促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期促進(jìn)細(xì)胞增殖。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-324-5p表達(dá)后可緩解雨蛙肽素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡情況，即miR-324-5p過(guò)表達(dá)可抑制胰腺炎腺泡細(xì)胞AR42J凋亡，檢測(cè)線粒體途徑相關(guān)蛋白表達(dá)。Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高可通過(guò)抑制線粒體凋亡途徑活化進(jìn)行抑制細(xì)胞凋亡，Bax蛋白表達(dá)水平升高可通過(guò)促使Cyt-C穿過(guò)線粒體膜而激活線粒體凋亡途徑進(jìn)而激活酶切caspase-3蛋白導(dǎo)致細(xì)胞凋亡〔15,16〕。提示miR-324-5p過(guò)表達(dá)可降低雨蛙肽素誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞凋亡水平，抑制凋亡因子。

CARD9屬于CARD蛋白家族成員，研究表明CARD9可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)而參與感染性疾病等發(fā)生及發(fā)展過(guò)程〔17〕。研究表明AP發(fā)展過(guò)程中涉及單核-巨噬細(xì)胞激活，CARD9在巨噬細(xì)胞中高表達(dá)并可通過(guò)與Bcl-10結(jié)合進(jìn)而激活下游轉(zhuǎn)錄因子-核因子(NF-κB)等信號(hào)通路，而NF-κB信號(hào)通路激活可加重AP疾病嚴(yán)重程度〔18,19〕。許宏敏〔20〕研究表明老年AP患者單核細(xì)胞中CARD9表達(dá)水平升高并可通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路進(jìn)而形成炎癥因子。沉默CARD9可抑制NF-κB和P38MAPKs途徑進(jìn)而減輕大鼠重癥AP，CARD9過(guò)表達(dá)可加重AP疾病嚴(yán)重程度〔21,22〕。本研究結(jié)果說(shuō)明CARD9表達(dá)水平升高可能是誘發(fā)AP的主要原因。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)抑制CARD9表達(dá)后可提高胰腺炎腺泡細(xì)胞AR42J增殖活性，降低AR42J細(xì)胞凋亡率。本研究采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證CARD9是miR-324-5p的靶基因，上調(diào)miR-324-5p表達(dá)可抑制CARD9表達(dá)，同時(shí)為明確miR-324-5p是否通過(guò)靶向CARD9而影響AR42J細(xì)胞增殖及凋亡能力，通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-324-5p mimic與pcDNA-CARD9共轉(zhuǎn)染至雨蛙肽誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞中，結(jié)果說(shuō)明上調(diào)miR-324-5p可通過(guò)抑制CARD9表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)AR42J細(xì)胞增殖，降低雨蛙肽誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞凋亡率，其可能是通過(guò)上調(diào)CyclinD1、Bcl-2蛋白表達(dá)及下調(diào)p21、 Bax蛋白表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。提示miR-324-5p過(guò)表達(dá)可抑制靶基因CARD9表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)胰腺炎腺泡細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。

綜上，miR-324-5p與CARD9存在靶向關(guān)系，miR-324-5p可通過(guò)靶向調(diào)控CARD9表達(dá)促進(jìn)胰腺炎腺泡細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡。但關(guān)于miR-324-5p是否同時(shí)靶向其他下游靶基因及其可能作用信號(hào)通路均有待進(jìn)一步研究。