肌動蛋白凝膠蛋白在食管鱗癌中的表達及其與臨床病理因素的關系

趙樂 常永超 許德英 程國平

(河南科技大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，河南 洛陽 471003)

肌動蛋白凝膠蛋白(Transgelin)是一種肌動蛋白結(jié)合蛋白，是平滑肌細胞分化的早期標志物〔1〕。它參與了許多生物學活動，包括調(diào)節(jié)肌纖維的收縮性、細胞的分化、組織侵襲等〔2～5〕。近年來，關于Transgelin與腫瘤的關系及與腫瘤預后的研究逐漸成為熱點，不斷有研究表明，Transgelin在許多腫瘤如肝癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、胃癌、肺癌等組織中呈現(xiàn)高表達，其表達產(chǎn)物對患者的早期診斷及術(shù)后評價等方面具有重要作用〔6～10〕。但是，Transgelin在食管鱗癌中的研究尚未見報道。本實驗旨在通過免疫組織化學的方法，分析Transgelin在食管鱗癌中的表達，探討Transgelin在食管癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，并且通過分析患者的臨床病理特征與生存預后之間的關系，為食管鱗癌的評估預后提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1材料 收集2010～2012 年河南科技大學第一附屬醫(yī)院手術(shù)切除的236例食管鱗癌新鮮組織標本，中位年齡68.6歲。組織學分級Ⅰ～Ⅱ級156例，Ⅲ～Ⅳ級80例。另同時收集同一患者癌周不典型增生黏膜208例及遠端正常黏膜188例，均經(jīng)病理證實。以上患者術(shù)前均簽署知情同意書并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2免疫組織化學染色法檢測Transgelin蛋白的表達 采用生物素蛋白-過氧化物酶(SP)法進行Transgelin蛋白檢測。一抗兔抗人Transgelin多克隆抗體購自香港ABCAM公司，SP試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。一抗稀釋倍數(shù)為1∶150。磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。所有標本經(jīng)脫蠟、梯度乙醇水化、3%過氧化氫(H2O2)消除內(nèi)源性過氧化物酶、PBS洗3遍、檸檬酸鹽高壓修復，自然冷卻后加封閉山羊血清室溫孵育15 min，然后加入1∶150稀釋的一抗4℃過夜，PBS漂洗3遍，加二抗孵育15 min，PBS洗3遍，加辣根過氧化物酶(HRP)孵育15 min，PBS洗3遍，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染，鹽酸乙醇分化、脫水后封片保存。鏡下顯示胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。

1.3免疫組化染色判斷標準 Transgelin蛋白陽性表達呈棕黃色，定位于細胞質(zhì)。高倍鏡下隨機選取5個視野，按著色深淺和陽性細胞所占的百分比進行判定。①按細胞著色深淺判斷：0分，不著色；1分，淺黃色；2分，棕黃色；3分，棕褐色。②按陽性細胞所占百分比判斷：0～5%，0分；6%～29%，1分；30%～70%，2分，>70 %，3分。取①、②兩項的乘積作為最終的判斷標準〔11〕，以表達評分的均值為分界，分為Transgelin低表達組和Transgelin高表達組。

1.4隨訪 236例患者中，218例患者獲得5年隨訪資料，隨訪截止時間為2018年12月(隨訪時間8～251個月)，18例患者因聯(lián)系方式變更等原因造成失訪，失訪率7.6%。

1.5統(tǒng)計學方法 應用GraphPad Prism6.0(GraphPad)和SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行χ2檢驗，Kaplan-Meier方法繪制生存曲線，Log-Rank檢驗進行組間比較，應用Cox風險比例回歸模型進行多因素分析。

2 結(jié) 果

2.1食管組織中Transgelin蛋白的表達 從正常的食管黏膜到癌旁不典型增生進而發(fā)展到食管癌的過程中Transgelin的表達量呈上升趨勢，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1、表1。

2.2食管鱗癌組織中Transgelin蛋白的表達與臨床病理因素的關系 食管癌組織中Transgelin蛋白的表達與患者的性別、年齡、腫瘤直徑均無關(P>0.05)；與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移有關(P<0.05)，見表2。

圖1 Transgelin在食管組織中的免疫組化結(jié)果(×400)

表1 Transgelin蛋白在正常食管黏膜、癌旁不典型增生組織及癌組織中的表達(n)

表2 不同臨床病理因素的食管癌組織中Transgelin蛋白的表達(n)

2.3生存分析 236例食管鱗癌患者，手術(shù)時間為2010～2012年，生存時間2～89個月，平均生存時間為36個月。從2010～2018年，236例食管鱗癌患者存活133例，死亡103例，5年生存率為56.3%。按照食管鱗癌組織中Transgelin的表達評分均值6分為界，分為Transgelin低表達組(156例)和Transgelin高表達組(80例)，Kaplan-Meier生存曲線顯示Transgelin高表達組的患者比低表達組的患者5年生存率低，見圖2。

圖2 Transgelin高表達及低表達食管鱗癌患者生存曲線

進一步對可能影響患者生存預后的臨床病理因素進行單因素(Log-Rank檢驗)和多因素(Cox比例風險模型)分析，單因素生存分析顯示，腫瘤的TNM 分期(P<0.05)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.05)、遠處轉(zhuǎn)移(P<0.05)與食管鱗癌患者術(shù)后的生存時間相關；而患者的年齡、性別、腫瘤直徑與生存時間無明顯相關(表2)。多因素Cox比例風險回歸模型分析顯示，TNM分期(P<0.05)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.05)、遠處轉(zhuǎn)移(P<0.05)為影響結(jié)食管鱗患者預后的獨立危險因素。見表3。

表3 食管癌預后相關因素的單因素和多因素生存分析

3 討 論

Transgelin其蛋白結(jié)構(gòu)由一個N-端鈣調(diào)蛋白同源結(jié)構(gòu)域和一個C-端鈣調(diào)蛋白重復序列組成，是平滑肌細胞的重要組成部分，直接與肌動蛋白細胞骨架結(jié)合，參與調(diào)節(jié)肌纖維的收縮、細胞的分化及組織的侵襲等〔12～14〕。很長一段時間，研究者僅僅把Transgelin定義為平滑肌細胞分化的標志。近年來，越來越多的研究證實，Transgelin直接或間接的參與到許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展中。

本實驗通過免疫組化檢測Transgelin在食管正常黏膜、癌旁不典型增生及食管鱗癌中的陽性率，從而證明Transgelin在食管癌中呈高表達。同時，Transgelin在正常食管黏膜、癌旁不典型增生組織及鱗癌組織中的蛋白表達量依次增高，提示Transgelin與食管癌的發(fā)生、發(fā)展關系密切，說明Transgelin是食管癌發(fā)生的早期事件。本研究還發(fā)現(xiàn)，在不同分化級別的食管癌組織中Transgelin的表達有明顯差異，說明癌細胞的分化程度與Transgelin的表達程度相關；有淋巴轉(zhuǎn)移的組織與無淋巴轉(zhuǎn)移的組織表達程度亦有顯著差異，表明Transgelin不止參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，還與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關。Rao等〔15〕在乳腺癌中發(fā)現(xiàn)，Transgelin與乳腺癌的分化程度密切相關，低分化乳腺癌的表達強度明顯高于高分化乳腺癌。Lee等〔16〕也表明Transgelin在肝癌中的表達較高，促進了肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移〔16〕。

本研究提示Transgelin對于判斷食管鱗癌患者的預后具有價值。而進一步單因素及多因素回歸分析結(jié)果顯示，Transgelin的表達程度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期與食管鱗癌患者術(shù)后生存時間相關，其中Transgelin表達程度，TNM分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移為食管鱗癌患者預后的獨立危險因素，這一結(jié)果支持Transgelin對評估食管鱗癌患者的預后具有一定價值。本研究從臨床角度證實了Transgelin與食管鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移的關系及Transgelin對于評估食管鱗癌患者生存預后的價值。

總之，Transgelin在食管癌組織中的表達升高，其高表達可能與食管癌的發(fā)生有關，Transgelin有可能成為一個新的診斷食管癌的腫瘤標志物。