SIRT3基因在老年膀胱癌組織中表達(dá)及對上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

蔡波 邢錢偉 管楊波 吳優(yōu) 郭新

(南通大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科，江蘇 南通 226001)

膀胱癌是一類病因多且復(fù)雜、發(fā)病率較高的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，大部分膀胱癌患者最初明確診斷時(shí)多為分化良好或中等分化的表淺性膀胱尿路上皮癌，采取手術(shù)治療預(yù)后較好〔1〕。但由于膀胱尿路上皮癌細(xì)胞增殖和浸潤易發(fā)生浸潤性或轉(zhuǎn)移性膀胱癌，給臨床治療帶來巨大挑戰(zhàn)，特別是老年患者由于上皮細(xì)胞分化低下而5年生存率更低〔2〕。腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力涉及多種作用機(jī)制，研究已證實(shí)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是該生物學(xué)行為中胚胎發(fā)育關(guān)鍵程序〔3〕。E-鈣黏素(E-cadherin)缺失被認(rèn)為是EMT發(fā)生一個(gè)重要標(biāo)志，而Snail、Slug為E-cadherin主要抑制因子，可通過下調(diào)E-cadherin表達(dá)而誘導(dǎo)EMT發(fā)生和腫瘤生物學(xué)行為改變。沉默信息調(diào)節(jié)因子家族(Sirtuins)可調(diào)控衰老和腫瘤發(fā)生和發(fā)展，其中以SIRT3基因變化最為敏感。研究顯示，結(jié)直腸癌細(xì)胞中SIRT3表達(dá)顯著低于癌旁正常組織，且低表達(dá)組總生存期(OS)、無進(jìn)展生存時(shí)間(PFS)縮短〔4〕。而另有研究表明肝癌、成纖維細(xì)胞腫瘤中SIRT3表達(dá)較低，且敲除SIRT3后可顯著抑制腫瘤發(fā)生和發(fā)展〔5〕。參閱國內(nèi)外報(bào)道和文獻(xiàn)，SIRT3在膀胱癌中的表達(dá)及其影響機(jī)制尚存在爭議。因此本研究從分子水平上探討老年膀胱癌組織中SIRT3的表達(dá)及其與EMT的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1臨床材料與組織標(biāo)本 經(jīng)病理檔案室收集2016年6月至2019年6月南通大學(xué)附屬醫(yī)院行手術(shù)切除的膀胱癌組織標(biāo)本及配對癌旁正常組織108例，獲取術(shù)中組織液氮冷凍后放入-80℃保存，記錄圍術(shù)期臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①參照相關(guān)診斷共識(shí)〔6〕，由主任醫(yī)師根據(jù)病灶處黏膜組織活檢術(shù)確診為膀胱癌；②參照TNM分期系統(tǒng)進(jìn)行腫瘤分期；③年齡65～85歲；④首次確診，既往未進(jìn)行過放化療；⑤不合并其他惡性腫瘤；⑥入院前半個(gè)月無嚴(yán)重急性感染病史。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并心、肝、腎等嚴(yán)重內(nèi)外科疾病者；②標(biāo)本保存不正確；③依從性特別差或中途要求退出的受試者；④臨床資料不完整，相關(guān)檢查不完善。男77例、女31例，年齡65～79歲，中位年齡75歲，<75歲47例、≥75歲61例，體重指數(shù)(BMI)<18.5 kg/m250例、≥18.5 kg/m258例，腫瘤直徑≤5 cm 62例、>5 cm 46例，Ⅰ～Ⅱ期49例、Ⅲ～Ⅳ期59例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移47例、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移61例，低分化56例、高中分化52例。

1.2細(xì)胞株與重組慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞 30株人膀胱癌UMUC3-141細(xì)胞購自上海北諾生物科技有限公司，研究獲得醫(yī)學(xué)倫理會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)符合癌細(xì)胞處理和使用相關(guān)規(guī)定。進(jìn)行原代培養(yǎng)，取其對數(shù)生長期的細(xì)胞，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(5×104個(gè)/孔)；用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后換液；待細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%，換無血清的培養(yǎng)基同步化24 h，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染；將人膀胱癌UMUC3-141細(xì)胞分為空白組(不作任何處理)、對照組(轉(zhuǎn)染空白SIRT3質(zhì)粒pGenesil2-Sirt3-shRNA)、SIRT3組(轉(zhuǎn)染SIRT3質(zhì)粒pcDNA3.1-Sirt3)各10株：轉(zhuǎn)染72 h后，倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果，綠色熒光細(xì)胞所占百分比>80%表示轉(zhuǎn)染成功可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3實(shí)驗(yàn)試劑和儀器 試劑：總RNA提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Takara公司)，RIPA蛋白裂解液(四川訊麥科技有限公司)，10%胎牛血清(吉泰生物有限公司)，DMEM培養(yǎng)液(廣州威佳科技有限公司)，BCA試劑盒(泉州睿信生物科技有限公司)，ECL發(fā)光試劑盒(北京沃比森科技有限公司)，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染說明書(上海恒斐生物科技有限公司)，空白SIRT3質(zhì)粒pGenesil2-Sirt3-shRNA、SIRT3質(zhì)粒pcDNA3.1-Sirt3(上海欽誠生物技術(shù)服務(wù)有限公司)，磷酸鹽緩沖液(PBS，杭州百思生物科技有限公司)，CCK-8溶液(長海李記生物科技有限公司)，Transwell小室(上海夏夷實(shí)業(yè)有限公司)，基質(zhì)膠(北京生東科技有限公司)，4%多聚甲醛溶液(廣州翔博生物科技有限公司)，蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(蘇州澤科生物科技有限公司)，胰蛋白酶(上海源葉生物科技有限公司)，無血清培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)。儀器：DMi8倒置熒光顯微鏡(德國徠卡顯微系統(tǒng)有限公司)、WJ-3-160T型CO2培養(yǎng)箱(上海新諾儀器設(shè)備有限公司)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)、MR-100酶標(biāo)儀(杭州奧盛儀器有限公司)。

1.4方法

1.4.1免疫組化染色法 取癌細(xì)胞和癌旁細(xì)胞石蠟塊，連續(xù)厚度為4 μm的切片，烤片4～5 h后脫蠟處理；將切片放入加熱沸騰的含抗原修復(fù)液高壓鍋中進(jìn)行高溫修復(fù)，冷卻后PBS沖洗3次；滴加3% H2O2100 μl，置入37℃孵育箱20 min，PBS沖洗3次；滴加10%山羊血清100 μl，室溫孵育15～20 min；每張切片組織上快速均勻滴加一抗各100 μl，置于 37℃孵育箱1 h，PBS沖洗3次；孵育二抗，各滴加二抗100 μl，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，顯色好的切片反復(fù)沖洗，直至鏡下觀察細(xì)胞核變藍(lán)；參考相關(guān)文獻(xiàn)〔7〕計(jì)算陽性表達(dá)情況。

1.4.2Western印跡法 取癌細(xì)胞和癌旁細(xì)胞石蠟塊，加蛋白裂解液、勻漿、離心，使用BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度；取總蛋白上樣，電泳、切膠、轉(zhuǎn)膜、TBST封閉；加入SIRT3、E-cadherin、Snail、Slug一抗(1∶500)、GAPDH一抗(1∶2 000)，4℃冰箱過夜；TBST緩沖液漂洗，加山羊抗兔二抗抗，25℃搖床1 h；洗膜，使用ECL發(fā)光試劑盒曝光、顯影；以GAPDH為內(nèi)參蛋白，分析各條條帶的灰度值(ECL發(fā)光試劑盒對PVDF膜進(jìn)行曝光顯影)，成像掃描分析系統(tǒng)測定內(nèi)參和目的條帶的灰度值。

1.4.3CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 傳代培養(yǎng)3組UMUC3-141細(xì)胞，取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(2×103個(gè)/孔)；待細(xì)胞貼壁后，每孔加入10 μl CCK-8溶液，于5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)180 min；AMR-100酶標(biāo)儀測定12 h、24 h、36 h、48 h時(shí)450 nm波長處的光密度(OD)值，細(xì)胞增殖率= (研究組細(xì)胞OD/空白組細(xì)胞OD)×100%。

1.4.4Transwell小室實(shí)驗(yàn) 調(diào)整3組UMUC3-141細(xì)胞濃度至5×108/L，于Transwell小室上室中加入60 μl基質(zhì)膠，下室中加600 μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；棄上室液體，4%多聚甲醛溶液固定15 min，HE染色試劑盒染色30 min，于倒置熒光顯微鏡下觀察并計(jì)算穿過小室膜的平均細(xì)胞數(shù)，以此表示細(xì)胞侵襲能力。

1.4.5劃痕實(shí)驗(yàn) 取3組UMUC3-141細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，吹打至細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×108/L；接種于48孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)80%，用槍頭沿著與皿底垂直方向劃痕；PBS洗滌3次，加入無血清培養(yǎng)基，于5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)胞遷移軌跡。

1.4.6Western印跡檢測EMT調(diào)控因子表達(dá)量 取3組細(xì)胞，參照“1.4.2”進(jìn)行Western印跡法檢測，獲得3組E-cadherin、Snail、Slug與β-actin的灰度值比值。

1.4.7免疫熒光法觀察癌細(xì)胞形態(tài)變化 取3組細(xì)胞，沖洗、固定、風(fēng)干，在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30 min；滴加足夠量的稀釋好的一抗并放入濕盒，4℃孵育過夜；次日用PBST浸洗爬片3次，每次3 min，吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗，濕盒中20～37℃孵育1 h，PBST浸洗切片3次，每次3 min；滴加DAPI避光孵育5 min，對標(biāo)本進(jìn)行染核，PBST 5 min、4次洗去多余DAPI；用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，獲得熒光顯微鏡下癌細(xì)胞形態(tài)圖像。

1.5觀察指標(biāo) ①膀胱癌組織和癌旁正常組織中SIRT3及EMT標(biāo)志基因E-cadherin、Snail、Slug表達(dá)水平，分析SIRT3與E-cadherin、Snail、Slug相關(guān)性；②膀胱癌組織和癌旁正常組織中SIRT3及EMT標(biāo)志基因E-cadherin陽性表達(dá)率；③SIRT3表達(dá)與膀胱癌患者臨床病理特征關(guān)系；④空白組(不作任何處理)、對照組(轉(zhuǎn)染空白SIRT3質(zhì)粒pGenesil2-Sirt3-shRNA)、SIRT3組(轉(zhuǎn)染SIRT3質(zhì)粒pcD-NA3-1-Sirt3)3組癌細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力及E-cadherin、Snail、Slug表達(dá)量。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1不同組織的陽性率比較 SIRT3主要定位于膀胱癌細(xì)胞核或胞質(zhì)中，呈藍(lán)色顆粒，在膀胱癌中陰性表達(dá)；E-cadherin、Snail、Slug主要定位于細(xì)胞膜中，E-cadherin呈藍(lán)色顆粒，Snail、Slug呈棕黃色顆粒。膀胱癌組織中SIRT3、E-cadherin表達(dá)明顯低于癌旁正常組織(P<0.05)，Snail、Slug明顯高于癌旁正常組織(P<0.05),見圖1，表1。

圖1 SIRT3、E-cadherin、Snail、Slug表達(dá)(DAB，×100)

表1 不同組織的陽性率對比

2.2不同組織蛋白相對表達(dá)量比較 膀胱癌組織中SIRT3、E-cadherin表達(dá)量明顯低于癌旁正常組織(P<0.05)，Snail、Slug表達(dá)量明顯高于癌旁正常組織(P<0.05)，見圖2,表2。

2.3SIRT3與E-cadherin、Snail、Slug相關(guān)性 SIRT3與E-cadherin呈正相關(guān)(r=0.232,P=0.022),與Snail、Slug呈負(fù)相關(guān)(r=-0.553,P<0.001;r=-0.248,P=0.014)。

2.4SIRT3與膀胱癌患者臨床病理特征的關(guān)系分析 性別、BMI、分化程度不同的膀胱癌患者，癌組織中SIRT3陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；年齡≥75歲、腫瘤直徑>5 cm、腫瘤分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的膀胱癌患者SIRT3陽性表達(dá)率明顯低于年齡<75歲、腫瘤直徑≤5 cm、腫瘤分期Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的膀胱癌患者SIRT3陽性表達(dá)率(P<0.05)，見表3。

圖2 SIRT3、E-cadherin、Snail、Slug蛋白表達(dá)(Western印跡)

表2 不同組織蛋白相對表達(dá)量對比

表3 SIRT3陽性表達(dá)與膀胱癌患者臨床病理特征的關(guān)系〔n(%)〕

2.53組UMUC3-141細(xì)胞增殖率分析 轉(zhuǎn)染SIRT3后，UMUC3-141細(xì)胞增殖受到抑制；24 h、36 h、48 h時(shí)，SIRT3組UMUC3-141細(xì)胞增殖率明顯低于對照組、空白組(P<0.05)，空白組和對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。SIRT3組UMUC3-141細(xì)胞增殖率隨時(shí)間延長增殖率下降速度更顯著(P<0.05)，見表4。

2.63組UMUC3-141細(xì)胞侵襲能力 空白組、對照組UMUC3-141細(xì)胞向器官表面靠攏，基底層可見較多偽足，形成的癌巢較大；SIRT3組UMUC3-141細(xì)胞較少，不見偽足或僅有少量偽足，未形成癌巢。見圖3。轉(zhuǎn)染SIRT3后，UMUC3-141細(xì)胞侵襲能力受到抑制；SIRT3組UMUC3-141細(xì)胞數(shù)(28.69±3.50)明顯低于對照組(78.21±15.83)、空白組(75.05±16.04，P<0.05)，空白組和對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.73組UMUC3-141細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力分析 空白組、SIRT3組UMUC3-141細(xì)胞在劃痕48 h后逐漸愈合、劃痕變小，SIRT3組UMUC3-141細(xì)胞在劃痕48 h后未發(fā)生愈合、劃痕甚至變大。見圖4。轉(zhuǎn)染SIRT3后，SIRT3組UMUC3-141細(xì)胞轉(zhuǎn)移率(10.23±3.55)明顯低于對照組(82.31±9.62)、空白組(83.68±9.35，P<0.05)，空白組和對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.8SATB1過表達(dá)誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞EMT發(fā)生 免疫熒光結(jié)果顯示，空白組和對照組UMUC3-141細(xì)胞為卵圓形，轉(zhuǎn)染SATB1后UMUC3-141細(xì)胞為長紡錘狀、呈典型EMT形態(tài)學(xué)改變，見圖5。

表4 3組轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)UMUC3-141細(xì)胞增殖率比較

圖3 3組UMUC3-141細(xì)胞侵襲能力(HE，×400)

圖4 3組UMUC3-141細(xì)胞遷移能力(HE，×400)

圖5 UMUC3-141細(xì)胞形態(tài)(DAPI染色，×400)

2.93組UMUC3-141標(biāo)志基因蛋白組對表達(dá)量比較 轉(zhuǎn)染SIRT3后，SIRT3組EMT標(biāo)志基因蛋白E-cadherin升高而Snail、Slug表達(dá)下降；且SIRT3組E-cadherin明顯高于對照組、空白組而Snail、Slug明顯低于對照組、空白組(P<0.05)，空白組和對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表5，圖6。

表5 三組UMUC3-141標(biāo)志基因蛋白相對表達(dá)量比較

圖6 轉(zhuǎn)染SIRT3后各組SIRT3、E-cadherin、Snail、Slug表達(dá)(Western印跡)

3 討 論

SIRT3基因自發(fā)現(xiàn)以來已被證實(shí)可參與多種腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移過程：孫軍等〔8〕研究顯示在非小細(xì)胞肺癌組織中SIRT3呈低表達(dá)，且低表達(dá)SIRT3組侵襲能力更高；李攬亞等〔9〕指出高表達(dá)SIRT3可抑制卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移過程；Ma等〔10〕的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SIRT3在腎癌細(xì)胞中低表達(dá)，上調(diào)SIRT3表達(dá)可抑制癌細(xì)胞血管浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且預(yù)示著該病預(yù)后較好。本研究結(jié)果說明SIRT3下調(diào)可促進(jìn)尿路上皮腫瘤發(fā)生。此時(shí)膀胱癌組織中EMT標(biāo)志基因E-cadherin下降而Snail、Slug升高，Snail、Slug因子為上皮細(xì)胞標(biāo)志性蛋白E-cadherin直接轉(zhuǎn)錄抑制因子，考慮EMT發(fā)生與SIRT3相關(guān)。相關(guān)性結(jié)果顯示SIRT3與E-cadherin呈正相關(guān)而與Snail、Slug呈負(fù)相關(guān)，考慮SIRT3下調(diào)可誘導(dǎo)EMT發(fā)生，進(jìn)而促進(jìn)膀胱癌侵襲轉(zhuǎn)移。

基于EMT發(fā)生途徑，多項(xiàng)研究證實(shí)EMT為多種腫瘤原位侵襲和轉(zhuǎn)移基礎(chǔ)〔11，12〕。王路明等〔13〕發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂盼通過抑制 SIRT3通路,促進(jìn)ROS產(chǎn)生,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞增殖和遷移,從而發(fā)揮抗口腔鱗狀細(xì)胞癌作用。Li等〔14〕指出SIRT3可通過磷酸甲基化參與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄、翻譯過程，進(jìn)而調(diào)控基因組織。SATBI可與尿路上皮膜上E-cadherin蛋白結(jié)合而發(fā)揮維持細(xì)胞間黏附狀態(tài)作用。當(dāng)機(jī)體被病毒、毒素等刺激時(shí)，SIRT3蛋白可大量缺失而抑制E-cadherin分泌，導(dǎo)致E-cadherin下調(diào)而其抑制因子Snail、Slug進(jìn)一步高表達(dá)，加快EMT發(fā)生，進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞進(jìn)展。相關(guān)研究證實(shí)了SIRT3蛋白和EMT通路之間的關(guān)系，提出SIRT3表達(dá)可抑制膀胱組織及腎組織上皮細(xì)胞EMT通路傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄〔15，16〕。本研究結(jié)果提示過表達(dá)SIRT3對促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡、而抑制癌細(xì)胞生長重要作用。這與既往報(bào)道結(jié)果相似，宋春麗等〔17〕分析SIRT3基因在肝癌細(xì)胞老化的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SIRT3基因過表達(dá)可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞衰老。Lee等〔18〕研究發(fā)現(xiàn)SIRT3過表達(dá)可以通過抑制Src/FAK信號(hào)通路達(dá)到抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移的作用，從而降低癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。

綜上所述，SIRT3在膀胱癌中呈低表達(dá)，低水平SIRT3可促進(jìn)膀胱癌發(fā)生；過表達(dá)SIRT3可抑制EMT發(fā)生而抑制癌癥發(fā)生和進(jìn)展，有望成為膀胱癌轉(zhuǎn)移和侵襲過程中的一種新的生物治療靶點(diǎn)因子。但由于時(shí)間限制、樣本量小，尚未明確膀胱癌中SATBI誘導(dǎo)細(xì)胞EMT的信號(hào)通路，仍需設(shè)計(jì)更為嚴(yán)密的、多中心、大樣本、雙盲的研究進(jìn)一步分析相關(guān)機(jī)制。