郭義 林俊
(萍鄉(xiāng)市中醫(yī)院骨科,江西 萍鄉(xiāng) 337000)
椎間盤退變是由多種因素引起的一種退行性疾病。隨著人口老齡化和預(yù)期壽命的延長(zhǎng),發(fā)病率逐漸增加,給患者帶來(lái)了極大的痛苦和沉重的社會(huì)負(fù)擔(dān)〔1〕。髓核變性是早期椎間盤退變的主要病理變化,表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的逐漸變化。ECM主要由聚集蛋白聚糖和Ⅱ型膠原(Col2a1)組成,且其逐漸減少,Ⅰ型膠原取代Col2a1,導(dǎo)致纖維化和彈性模量的損失〔2〕。髓核變性治療的相應(yīng)缺陷包括手術(shù)或保守治療。據(jù)推測(cè),隨著衰老和變性,髓核細(xì)胞經(jīng)歷表型轉(zhuǎn)化并被分泌非典型纖維ECM的成纖維細(xì)胞所取代〔3〕。這表明細(xì)胞微環(huán)境的變化和分解代謝介質(zhì)的存在可能促進(jìn)異常增殖和分化。細(xì)胞因子介導(dǎo)髓核細(xì)胞功能的轉(zhuǎn)變得到了其他研究的支持。此外,類似于軟骨細(xì)胞,本課題組前期研究表明,椎間盤細(xì)胞的增殖和分化依賴于Notch信號(hào)通路〔4〕。血府逐瘀湯是一種中醫(yī)處方劑名,由各種中草藥及果實(shí)種仁按照一定的比例配合而成,具有一定的活血化瘀,行氣止痛作用。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)9是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β超家族的成員,它是一種強(qiáng)生長(zhǎng)分化因子,最初是從生長(zhǎng)小鼠的肝臟中分離出來(lái)的〔5〕。它在間充質(zhì)干細(xì)胞的軟骨形成分化的促進(jìn)運(yùn)動(dòng)中起重要作用。髓核和軟骨中ECM的主要成分相似,其本質(zhì)是聚集蛋白聚糖和Col2a1。本文主要探討血府逐瘀湯通過(guò)影響B(tài)MP9表達(dá)抑制Notch信號(hào)通路調(diào)節(jié)髓核細(xì)胞增殖的機(jī)制。
1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠36只,6~8周齡,體重190~220 g,各實(shí)驗(yàn)大鼠置于相同的環(huán)境中,12/12 h黑暗循環(huán),并將大鼠在溫控(22±2)℃的房屋中飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)程序均經(jīng)動(dòng)物保護(hù)和使用委員會(huì)批準(zhǔn),并根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
1.2建立腰椎間盤組織模型并分組 隨機(jī)分為3組,對(duì)照組12只,其他24只。通過(guò)腹膜內(nèi)注射10%水合氯醛給大鼠施用麻醉(3 ml/kg)。將大鼠麻醉,置于具有固定肢體的俯臥位。使用脫毛劑制備背部皮膚上4 cm×8 cm的區(qū)域。然后將滅菌的覆蓋片放在大鼠上,沿著后腰的棘突切割中線切口。切割皮膚后,進(jìn)行骨膜下剝離以充分暴露棘突,關(guān)節(jié)突和椎板。咬骨鉗用于去除棘突,關(guān)節(jié)突,棘上韌帶和棘突間韌帶。雙側(cè)豎脊肌切開(kāi)。然后將皮下筋膜和皮膚逐層縫合回來(lái)。給藥方法:動(dòng)物模型建立后,將其中12只大鼠腹腔注射50 mg/kg血府逐瘀湯。6 w后,再次對(duì)標(biāo)記的大鼠進(jìn)行磁共振成像(MRI)檢查,然后處死所有大鼠。收集腰椎間盤組織將一個(gè)片段中間固定在2%戊二醛中,將另外兩個(gè)片段保存在-20 ℃。
1.3實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1髓核原代細(xì)胞培養(yǎng)及BMP9轉(zhuǎn)染 使用的腺病毒包括攜帶綠色熒光蛋白基因的腺病毒(Ad-GFP),腺病毒介導(dǎo)的BMPq(Ad-BMP)9和Ad-BMP9抑制劑,髓核 P0傳代通過(guò)使用0.25%胰蛋白酶消化(NPC),傳代,并返回培養(yǎng)箱4 h。此時(shí)大多數(shù)細(xì)胞黏附在板上。添加Polybrene和不同組的腺病毒(MOI值100),并且感染效率保持在50%。使其髓核細(xì)胞進(jìn)行BMP9超表達(dá)與抑制表達(dá),感染后6~8 h更換培養(yǎng)基,在感染24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
1.3.2蛋白印記分析 將椎間盤組織在RIPA裂解緩沖液中于4 ℃勻漿5 min,得到10%勻漿。RIPA緩沖液中于4 ℃裂解45 min,離心(10 000 r/min,4 ℃,5 min)并收集上清液用于下一個(gè)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)制造商的方案,使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒測(cè)量總蛋白質(zhì)濃度。在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì)樣品并轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。將膜在含有5%脫脂奶粉的tris緩沖鹽水和吐溫20(TBST)中封閉1.5 h。用TBST洗滌膜,然后與相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)-綴合的第二抗體(1∶5 000)在室溫下孵育1.5 h。再次洗滌膜后,用增強(qiáng)的電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑觀察結(jié)合的抗體,并使用Quantity One軟件通過(guò)光密度分析進(jìn)行定量。GAPDH的檢測(cè)用作對(duì)照。
1.3.3免疫熒光和髓核細(xì)胞鑒定 將原代髓核細(xì)胞消化,重懸于培養(yǎng)基中,以5×104個(gè)細(xì)胞/孔接種于24孔板中的無(wú)菌細(xì)胞載玻片上,并培養(yǎng)24 h。用PBS洗滌細(xì)胞,并使用4%多聚甲醛在室溫下將細(xì)胞固定20 min。用PBS洗滌細(xì)胞3次,并且每次加入0.5%Triton 10 min。用PBS洗滌細(xì)胞,并使用山羊血清阻斷非特異性結(jié)合1 h。血清被完全吸入,并將細(xì)胞與第一抗體(兔抗Col2a1或小鼠抗聚集蛋白聚糖在4 ℃過(guò)夜孵育。將板在室溫下放置1 h并用PBS洗滌。在避免光照的同時(shí)進(jìn)行后續(xù)步驟。將第二抗體(山羊抗兔,紅色熒光;山羊抗小鼠,綠色熒光)溫育1 h。用PBS洗滌細(xì)胞,并用4′6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)將細(xì)胞核染色10 min。用PBS洗滌載玻片,轉(zhuǎn)移到載玻片上,用甘油密封后用熒光顯微鏡拍照。在隨后的實(shí)驗(yàn)中通過(guò)使用具有紅色熒光的二抗進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)髓核細(xì)胞中ECM的表達(dá)。
1.3.4RNA提取和半定量RNA分析 通過(guò)使用GeneJET RNA純化試劑盒收集每組具有腺病毒感染的髓核細(xì)胞用于RNA提取。通過(guò)使用分光光度計(jì)測(cè)量RNA濃度。通過(guò)使用逆轉(zhuǎn)錄和反轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA合成試劑盒。使用以下反應(yīng)條件:在25 ℃下放置5 min,然后在42 ℃下放置60 min。通過(guò)在70 ℃加熱5 min終止反應(yīng)。使用以下反應(yīng)條件:在95 ℃下初始變性2 min,進(jìn)行1個(gè)循環(huán);在95 ℃變性30 s,在55 ℃退火30 s,在72 ℃延伸1 min;最后在72 ℃延伸5 min。使用1.5%瓊脂糖凝膠在80 V下進(jìn)行凝膠電泳35 min。RT-PCR引物序列:Notch1:上游引物:AGGGCTTCCATTGTATTGAGGT、下游引物:ATCATCTTGGCATCCCTCTTG;DLL1:上游引物:ACCACAGTCCATGCCATCCACT、下游引物:GTATATTTGGGACCCCGTAGA;BMP9:上游引物:ACGATCTGTTTCCCCTCATCT、下游引物:ATGCAGGGATGATGTTCTG;GAPDH:上游引物:CGACAACTTTGGCATTGTGG、下游引物:TAAGTCGATCCCTAGTGACAA。
1.3.5CCK8檢測(cè)髓核細(xì)胞增殖 使用CCK8測(cè)定法檢測(cè)BMP9對(duì)髓核細(xì)胞的增殖影響。除特異性結(jié)構(gòu)外,所有實(shí)驗(yàn)使用Ad-GFP作為對(duì)照組,并遵循前面提到的感染方法,并比較Ad-GFP和Ad-BMP9感染的細(xì)胞。將細(xì)胞接種于96孔板中。1×104細(xì)胞/孔,每組使用3個(gè)重復(fù)。在細(xì)胞感染后24 h加入CCK8試劑(10 ml),并將平板放回培養(yǎng)箱中2 h。通過(guò)自動(dòng)微板讀數(shù)器在450 nm下測(cè)量吸光度。
1.3.6TUNEL分析髓核細(xì)胞的凋亡率 根據(jù)制造商的說(shuō)明,使用ApopTag過(guò)氧化物酶原位凋亡檢測(cè)試劑盒評(píng)估細(xì)胞凋亡。簡(jiǎn)言之,從在室溫下用10 U/ml DNase Ⅰ處理20 min的正常細(xì)胞陽(yáng)性對(duì)照樣品。將切片用3.0%H2O2預(yù)處理,與末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶在37 ℃反應(yīng)1 h,然后與地高辛配基的核苷酸底物在37 ℃溫育30 min。在3,3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)中孵育5 min后,表現(xiàn)出DNA片段化的細(xì)胞核變?yōu)樯钭厣?。將組織切片用蘇木素復(fù)染,固定,并通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察。
1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析。
2.1各組BMP9 mRNA的相對(duì)表達(dá) 誘導(dǎo)模型組BMP9 mRNA表達(dá)較對(duì)照組明顯降低(1.15±0.22、3.26±0.18,P<0.05)。而血府逐瘀湯組BMP9 mRNA表達(dá)(2.88±0.31)較誘導(dǎo)模型組明顯升高(P<0.05)。
2.2CCK8檢測(cè)髓核細(xì)胞的增殖 模型誘導(dǎo)組髓核細(xì)胞的含量明顯低于對(duì)照組、血府逐瘀湯組〔41.4±2.47)、(82.35±1.52)、(73.52±3.23),P<0.05〕。見(jiàn)圖1。
圖1 CCK8檢測(cè)(×100)
2.3BMP9促進(jìn)髓核細(xì)胞中的ECM表達(dá) 模型誘導(dǎo)組聚蛋白多糖(Aggrecan)和Col2a1蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組(P<0.05),血府逐瘀湯組Aggrecan和Col2a1蛋白表達(dá)明顯高于模型誘導(dǎo)組(P<0.05)。見(jiàn)表1。
表1 各組Aggrecan和Col2a1蛋白表達(dá)比較
2.4BMP9對(duì)Notch信號(hào)配體mRNA表達(dá)的影響 通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑中BMP9對(duì)Notch1和DLL1的mRNA表達(dá)的影響,細(xì)胞培養(yǎng)組和BMP9轉(zhuǎn)染組Notch1和DLL1 mRNA明顯低于BMP9抑制轉(zhuǎn)染組(P<0.05)。細(xì)胞培養(yǎng)組和BMP9轉(zhuǎn)染組BMP9 mRNA表達(dá)明顯高于BMP9抑制轉(zhuǎn)染組(均P<0.05)。見(jiàn)表2,圖2。
2.5TUNEL分析 BMP9抑制轉(zhuǎn)染組較對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)組、BMP9轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率明顯升高,細(xì)胞活力明顯下降(均P<0.05)。見(jiàn)表3。
圖2 BMP9、Notch1和DLL1的mRNA檢測(cè)
表2 各組BMP9、Notch1和DLL1 mRNA表達(dá)情況
表3 各組髓核細(xì)胞的凋亡率、細(xì)胞活力測(cè)定
背痛是肌肉骨骼殘疾的主要原因,雖然確切原因尚不完全清楚,但椎間盤退變被廣泛接受為主要原因〔6〕。目前,沒(méi)有有效的疾病改善療法可用于背痛,主要是由于我們對(duì)椎間盤穩(wěn)態(tài)和變性的分子機(jī)制的有限理解。椎間盤退變是一種特殊的纖維軟骨組織,由髓核纖維環(huán),軟骨終板和生長(zhǎng)板軟骨組成〔7〕。Notch信號(hào)傳導(dǎo)是一種進(jìn)化上保守的途徑,在多種組織的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)中起重要作用,而其失調(diào)涉及多種疾病。隨著衰老和變性,髓核細(xì)胞經(jīng)歷表型轉(zhuǎn)化并被分泌非典型纖維細(xì)胞外基質(zhì)的成纖維細(xì)胞所取代〔8,9〕。這表明細(xì)胞微環(huán)境的變化和分解代謝介質(zhì)的存在可能促進(jìn)異常增殖和分化。細(xì)胞因子介導(dǎo)髓核細(xì)胞功能的轉(zhuǎn)變得到了其他研究的支持〔10〕。此外,類似于軟骨細(xì)胞,有研究表明,椎間盤細(xì)胞的增殖和分化依賴于Notch信號(hào)通路。Notch信號(hào)傳導(dǎo)主要由Notch受體(哺乳動(dòng)物中的Notch1-4)通過(guò)其配體(包括哺乳動(dòng)物中的DLL1的結(jié)合觸發(fā),兩者都在兩個(gè)相對(duì)細(xì)胞的表面上表達(dá)〔11,12〕。 Notch受體-配體結(jié)合激活Notch受體的兩個(gè)連續(xù)酶促切割,其將其細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(NICD)釋放到細(xì)胞質(zhì)中〔13〕。生理Notch信號(hào)傳導(dǎo)是維持關(guān)節(jié)軟骨所必需的,而Notch信號(hào)傳導(dǎo)的持續(xù)激活導(dǎo)致軟骨退化和骨關(guān)節(jié)炎〔14〕。
據(jù)報(bào)道Notch信號(hào)通路的所有成分,即受體,配體和靶基因,都在椎間盤細(xì)胞中表達(dá)〔15〕。本研究表明,Notch信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)維持椎間盤缺氧灶中髓核細(xì)胞增殖至關(guān)重要。BMP9是一種強(qiáng)生長(zhǎng)分化因子,在間充質(zhì)干細(xì)胞的軟骨形成分化運(yùn)動(dòng)中起重要作用〔16,17〕。之前的報(bào)道稱髓核和軟骨中ECM的主要成分相似,其本質(zhì)是聚集蛋白聚糖和Col2a1〔18,19〕。本研究結(jié)果說(shuō)明較椎間盤退變組大鼠升高,這表明誘導(dǎo)模型組ECM表達(dá)下降,對(duì)髓核細(xì)胞的生長(zhǎng)具有不利因素。通過(guò)血府逐瘀湯的藥物處理后,給藥組大鼠中Col2a1蛋白表達(dá)升高,對(duì)髓核細(xì)胞的增殖具有一定的促進(jìn)作用。研究表明Notch信號(hào)通過(guò)調(diào)節(jié)軟骨基質(zhì)中的合成代謝和分解代謝分子在關(guān)節(jié)維持和骨關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮雙重作用〔20〕。
本研究結(jié)果證實(shí)證明血府逐瘀湯可促進(jìn)BMP9表達(dá),而轉(zhuǎn)染高表達(dá)的BMP9髓核細(xì)胞抑制Notch1和DLL1在髓核細(xì)胞的生物功能,促進(jìn)了髓核細(xì)胞的增殖,為椎間盤退變疾病的治療提供了可能有效的方法,BMP9通過(guò)抑制Notch信號(hào)通路中的Notch1和DLL1從而干擾髓核細(xì)胞的增殖發(fā)育,其中血府逐瘀湯可促進(jìn)誘導(dǎo)模型組中BMP9的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)髓核細(xì)胞的增殖。