氨來(lái)呫諾引起腎性尿崩癥的機(jī)制

劉云濤 江攀 潘敬芳 張琦 張軍

(1三峽大學(xué)附屬仁和醫(yī)院內(nèi)分泌科，湖北 宜昌 443000；2重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院心內(nèi)科；3宣昌市夷陵醫(yī)院內(nèi)分泌科)

氨來(lái)呫諾(ALX)具有抗炎和抗過(guò)敏的作用，目前主要用來(lái)治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍與哮喘等〔1，2〕。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ALX可以通過(guò)抑制核因子κB抑制物激酶(IKK)ε和Tank結(jié)合激酶(TBK)1途徑來(lái)治療肥胖、2型糖尿病，可以提高脂肪組織的能量消耗，減輕體重，改善胰島素敏感性和減少脂肪組織的慢性炎癥因子〔3〕，但是其副作用尚未認(rèn)識(shí)，尚未見(jiàn)口服用于臨床的報(bào)道。我們前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ALX導(dǎo)致大鼠尿量增多，因此我們探討ALX誘導(dǎo)腎性尿崩癥的(CNDI)機(jī)制，這對(duì)今后ALX用于臨床代謝性疾病治療是一個(gè)警示。同時(shí)，如果IKKε參與CNDI的發(fā)生，這將是一個(gè)良好治療CNDI的靶基因，為今后的IKK-ε激動(dòng)劑治療CNDI提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 IKKε、水通道蛋白(AQP)2引物、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GADPH)引物由武漢博士德生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成。一抗、二抗分別購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司、武漢博士德生物工程有限公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。大鼠精氨酸加壓素(AVP)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1模型建立與分組 隨機(jī)選取野生型大鼠(WT)組10只，IKKε基因敲除大鼠(KL)組10只，體重200～220 g。實(shí)驗(yàn)大鼠均購(gòu)自上海南方模式生物科技有限公司，給予普通飼料，喂養(yǎng)于代謝籠單籠、單養(yǎng)，自由飲水和進(jìn)食，記錄尿量和飲水量。稀釋后的尿液加入電解質(zhì)標(biāo)液Ⅰ，搖勻后進(jìn)行尿離子含量檢測(cè)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)干預(yù) 將WT組和KL組大鼠每2只一組，分別給予ALX(購(gòu)自Cayman chemical公司)20、40、60、80、100 mg/kg灌胃，在A(yíng)LX灌胃時(shí)給予去氨加壓素(dDAVP，深圳翰宇藥業(yè)股份有限公司)1 μg/kg皮下注射〔4〕。于尿量增多24 h后禁水12 h后觀(guān)察24 h尿量變化。

1.2.3逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)IKKε、AQP2 mRNA 核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定兩組大鼠腎臟髓質(zhì)AQP2 mRNA、WT組IKKε mRNA，取-80℃冰箱中保存的新鮮冰凍腎髓質(zhì)，重量約為100 mg，按照Trizol一步法提取RNA，測(cè)定RNA濃度和純度。取等量RNA逆轉(zhuǎn)錄得到互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)。取適量cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列：IKKε上游引物5′-TGTACAAGGCCCGGAATAAG-3′，下游引物5′-CCTCCACTGCGAATAGCTTC-3′。AQP2上游引物：5′-TAGCCTTCTCCCGAGCAGTG-3′，下游引物5′-GCGGAGACGAGCACTTTGACA-3′。

1.2.4Western印跡測(cè)定IKKε、AQP2蛋白水平 KL組大鼠腎臟髓質(zhì)提取AQP2蛋白，WT組大鼠腎臟髓質(zhì)提取IKKε、AQP2蛋白，用β-actin作為內(nèi)部對(duì)照。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測(cè)系統(tǒng)顯示辣根過(guò)氧化物酶(HRP)耦聯(lián)抗體產(chǎn)生的信號(hào)，在柯達(dá)X膠片上曝光。用Bandscan4.3軟件進(jìn)行密度分析，確定蛋白質(zhì)水平作為頻帶強(qiáng)度的集成區(qū)域(像素)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1ALX誘導(dǎo)CNDI的劑量 ALX 20、40 mg/kg灌胃并不能明顯增加大鼠飲水量、尿量和AVP水平(P>0.05)，ALX 60、80、100 mg/kg灌胃后較灌胃前兩組大鼠飲水量、尿量、AVP水平明顯增加(P<0.01,P<0.05);尿比重顯著降低(P<0.01)，ALX 80、100 mg/kg灌胃與ALX 60 mg/kg灌胃相比較，大鼠尿量、飲水量、尿比重、AVP無(wú)顯著差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。ALX 60 mg/kg灌胃后較灌胃前兩組大鼠尿離子含量明顯減少(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表1 不同劑量ALX灌胃前后WT及KL組大鼠飲水量、尿量、尿比重、AVP水平比較

表2 ALX 60 mg/kg灌胃對(duì)尿離子的影響

2.2ALX導(dǎo)致多尿的時(shí)間依賴(lài)性 在A(yíng)LX60 mg/kg灌胃同時(shí)給予1 d dDAVP皮下注射，注射后24 h和48 h發(fā)現(xiàn)兩組大鼠尿量及尿比重?zé)o明顯變化(P>0.05)。ALX導(dǎo)致多尿24 h后禁水12 h，尿量、尿比重沒(méi)有明顯改變(P>0.05)。ALX60 mg/kg灌胃誘導(dǎo)的兩組大鼠多尿和低比重尿可持續(xù)48 h，從72 h開(kāi)始尿量逐漸減少，尿比重逐漸增加，至96 h尿量和尿比重接近正常，見(jiàn)表3。

表3 ALX 60 mg/kg灌胃后尿量和尿比重的時(shí)間依賴(lài)性變化及dDAVP、禁水實(shí)驗(yàn)的影響

2.3ALX對(duì)腎髓質(zhì)IKKε、AQP2表達(dá)的影響 WT組ALX 60 mg/kg灌胃后IKKε、AQP2的表達(dá)顯著降低(P<0.05)，KL組ALX灌胃后AQP2的表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表4，圖1，圖2。

表4 ALX 60 mg/kg灌胃對(duì)大鼠腎臟髓質(zhì)IKKε、AQP2表達(dá)的影響

1～4:WT組灌胃前、WT組灌胃后、KL組灌胃前、KL組灌胃后圖1 兩組ALX灌胃前后AQP2蛋白表達(dá)

圖2 WT組ALX灌胃前后IKKε蛋白表達(dá)

3 討 論

CNDI是以血漿AVP水平正?；蛏?，但腎臟不能正常濃縮尿液為特征的疾病〔5〕。本研究結(jié)果說(shuō)明ALX具有誘導(dǎo)CNDI發(fā)生的作用。ALX誘導(dǎo)CNDI有時(shí)間依賴(lài)性。

AQP2是腎臟集合管上的抗利尿激素(ADH)依賴(lài)性水通道，主要表達(dá)在集合管的主細(xì)胞上，選擇性地使水分子通過(guò)，并在A(yíng)VP的調(diào)節(jié)下，于頂膜和儲(chǔ)存囊泡之間轉(zhuǎn)換位置，AQP2最重要的功能是介導(dǎo)水的跨膜運(yùn)輸，在尿液濃縮中發(fā)揮了重要作用。已證實(shí)AQP2基因變異參與了CNDI的發(fā)生〔6〕。有研究發(fā)現(xiàn)給予大鼠高鋰飲食，可通過(guò)減少大鼠腎臟集合管AQP2表達(dá)減少，誘導(dǎo)CNDI發(fā)生〔4〕。研究還發(fā)現(xiàn)三苯氧胺可通過(guò)上調(diào)鋰劑誘導(dǎo)的CNDI大鼠集合管AQP2的表達(dá)，從而改善多尿癥狀〔7〕。有學(xué)者認(rèn)為，激活A(yù)QP2可能是CNDI的治療策略〔8〕。這些提示調(diào)控AQP2的表達(dá)在CNDI的發(fā)生具有重要作用。本研究結(jié)果提示ALX可能通過(guò)對(duì)AQP2的影響誘導(dǎo)了CNDI的發(fā)生。目前關(guān)于藥物和其他化合物對(duì)AQP2的影響研究十分有限，除了發(fā)現(xiàn)鋰劑對(duì)AQP2的表達(dá)具有抑制作用之外，還發(fā)現(xiàn)某些對(duì)IKKβ具有抑制作用的藥物和化合物如氯硝柳胺、血清垂體中葉素(IMD)-0354對(duì)AQP2、AQP4具有抑制作用〔9，10〕。而IKKε與IKKβ同屬I(mǎi)KK家族，兩者具有類(lèi)似的作用，并且在結(jié)構(gòu)上具有高度相似性〔11〕。ALX是IKKε的特異性抑制劑，本研究進(jìn)一步證實(shí)ALX對(duì)IKKε具有抑制作用。ALX誘導(dǎo)CNDI是否與IKKε有關(guān)，值得探討。本研究結(jié)果提示ALX誘導(dǎo)CNDI的發(fā)生與IKKε的表達(dá)降低無(wú)關(guān)。