腎衰飲對(duì)CRF大鼠TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路及炎癥狀態(tài)的影響

張亮 馬曉燕 王佳虹 遠(yuǎn)方 馬賢德 席瑞

(1遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110032；2遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院；3沈陽藥科大學(xué))

慢性腎衰竭(CRF)是可以由原發(fā)和繼發(fā)等多種原因引起的慢性腎臟疾病，導(dǎo)致腎單位逐漸失去功能，當(dāng)健存的腎單位不足以排出體內(nèi)代謝廢物和毒物時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致內(nèi)環(huán)境失衡，引起水、電解質(zhì)和酸堿平衡紊亂〔1〕。本病病程遷延，治療周期長(zhǎng)且易反復(fù)，西醫(yī)治療中出現(xiàn)諸多不良反應(yīng)。已有諸多實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明傳統(tǒng)中醫(yī)藥對(duì)于治療CRF存在一定的優(yōu)勢(shì)，可以改善患者的腎臟功能，延緩CRF的進(jìn)展，延長(zhǎng)進(jìn)入腎臟替代治療的時(shí)間，并減少并發(fā)癥的發(fā)生。

CRF的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，有證據(jù)表明這一過程中細(xì)胞信號(hào)通路通過多個(gè)細(xì)胞因子介導(dǎo)腎纖維化起了重要作用〔2〕，共同參與CRF的發(fā)生和發(fā)展?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)參與腎臟間質(zhì)纖維化的形成機(jī)制有炎癥、氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、增殖等。其中腎臟慢性炎癥是CRF進(jìn)展的重要機(jī)制，而toll樣受體(TLR)4在炎癥發(fā)生中發(fā)揮重要作用。有研究〔3〕發(fā)現(xiàn)在腎組織受損的過程中，死亡的腎臟細(xì)胞釋放自身細(xì)胞內(nèi)的因子，刺激免疫細(xì)胞釋放促炎因子，引起TLR4/MyD88信號(hào)通路被激活，促使腎臟炎癥的發(fā)生，進(jìn)一步證實(shí)了TLR4/髓樣細(xì)胞分化因子(MyD)88/核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB信號(hào)通路的活化在CRF的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。腎衰飲是馬曉燕教授長(zhǎng)期應(yīng)用于臨床治療腎衰病的常用方，并且經(jīng)臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)〔4〕及實(shí)驗(yàn)研究〔5〕證實(shí)該方藥治療CRF療效確切。本實(shí)驗(yàn)從慢性炎癥角度，研究腎衰飲對(duì)信號(hào)通路TLR4/MyD88/NF-κB及其下游炎癥因子表達(dá)情況的影響，探討腎衰飲干預(yù)CRF的作用機(jī)制，為臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取60只雄性SD大鼠，SPF級(jí)，6周齡，體重(180±20)g，在遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心常規(guī)飼養(yǎng)。

1.1.2藥物與試劑 腎衰飲由黃芪、太子參、菟絲子、砂仁、白術(shù)、茯苓、法半夏、白茅根、藿香、佩蘭、鱉甲、丹參、莪術(shù)、水蛭、水紅花子、大黃等組成。藥材均購(gòu)自遼寧省中醫(yī)院中草藥局；尿毒清顆粒(大黃、黃芪、白術(shù)、茯苓、白芍、丹參、車前草，15 g/袋，由廣州康臣藥業(yè)有限公司生產(chǎn))；腺嘌呤(批號(hào)：1122B051，美國(guó)Amresco公司)；血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號(hào)分別：C013-2、C011-2)；水合氯醛(北京Solarbio有限公司，批號(hào)：T8590)； 多聚甲醛(北京 Solarbio有限公司，批號(hào)：P8430)；蘇木素-伊紅(HE)染色、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒、TLR4、MyD88、NF-κB抗體(由博士德生物工程有限公司生產(chǎn))；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn))。

1.1.3儀器與設(shè)備 酶標(biāo)儀(thermo生產(chǎn)，MK3型)；電泳儀(上海天能科技有限公司生產(chǎn)，EPS300型)；數(shù)碼顯微鏡(德國(guó)徠卡公司生產(chǎn)，DM2000型)；凝膠成像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司，SF4000型)。

1.2方法

1.2.1分組與造模 將60只大鼠隨機(jī)分為正常組和造模組(分別為12只、48只)，正常組予0.9%NaCl溶液8 ml/(kg·d)灌胃，造模組按照參考文獻(xiàn)里Yokozawa法〔6〕〔予腺嘌呤懸濁液200 mg/(kg·d)灌胃〕制作大鼠腎衰模型，均連續(xù)灌胃21 d。用10%水合氯醛水溶液3.5 ml/kg腹腔注射麻醉，采集球后靜脈血1.5～2.0 ml，化驗(yàn)血Scr、BUN水平。正常組取2只，造模組取6只，分別處死取腎臟組織進(jìn)行HE染色，驗(yàn)證造膜成功。將造模成功大鼠再隨機(jī)分為模型組13只、尿毒清組12只、腎衰飲組12只。

1.2.2實(shí)驗(yàn)干預(yù) 腎衰飲組給予腎衰飲煎劑33.3 g/(kg·d)灌胃，每毫升藥液含生藥量為3.36 g；尿毒清組給予尿毒清顆粒以2.25 g/(kg·d)濃度溫水溶開后灌胃；模型組和正常組予0.9%Nacl溶液8 ml/(kg·d)灌胃，連續(xù)給藥4 w。

1.3樣本取材及檢測(cè)分析

1.3.1取材 各組大鼠連續(xù)給藥4 w后，測(cè)體重，予腹腔注射10%水合氯醛水溶液3.5 ml/kg以麻醉，剖腹，采集腹主動(dòng)脈血液。隨機(jī)選取2只大鼠腎組織用于檢測(cè)病理變化；各組剩余大鼠腎臟組織中隨機(jī)選取6例，左側(cè)腎臟置于2 ml凍存管中，-80℃保存，用于Western印跡檢測(cè)；右側(cè)腎臟浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定，用于免疫組織化學(xué)法檢測(cè)。

1.3.2HE染色 取腎臟組織常規(guī)脫水后，浸蠟、包埋，制備4 μm切片，烤片2 h后，二甲苯脫蠟兩次，然后梯度乙醇水化，行HE染色，梯度乙醇及二甲苯透明，中性樹膠封片，數(shù)碼顯微鏡下觀察病理改變并拍照。

1.3.3檢測(cè)各組血清Scr、BUN水平 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組血清Scr、BUN水平。

1.3.4ELISA檢測(cè)血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平 取各組血清樣本，自然融化，具體檢測(cè)方法按照ELISA試劑盒中附帶的說明書步驟進(jìn)行。

1.3.5Western印跡法檢測(cè)腎臟組織內(nèi)TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá) 取各組凍存的腎臟組織，用手術(shù)刀切取100 mg腎臟組織，剪碎，置于2 ml離心管中，并加入1 ml含苯甲基磺酰氟-蛋白酶抑制劑(PMSF)的組織裂解液，高速勻漿機(jī)制備勻漿，冰面上裂解15 min，低溫高速離心機(jī)14 000 r/min離心15 min，測(cè)定蛋白濃度后，加入5×蛋白上樣緩沖液，沸水浴5 min變性。按照40 μg/孔的上樣量進(jìn)行垂直電泳，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，封閉后，一抗(1∶400)孵育PVDF膜4℃過夜，二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，洗膜后，將PVDF膜置于凝膠成像分析系統(tǒng)中，并滴加電化學(xué)發(fā)光(ECL)工作液，采集圖像，并以凝膠成像分析系統(tǒng)中自帶軟件測(cè)定各目的蛋白條帶灰度值，并以目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值的比值作為該蛋白的相對(duì)表達(dá)水平，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.6免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腎臟組織內(nèi)TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá) 取固定好的腎臟組織，流水下充分沖洗，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋，制備5 μm厚石蠟切片，然后二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化后，滴加3%過氧化氫去除內(nèi)源性過氧化物酶，正常山羊血清封閉后，滴加一抗工作液(TLR4為1∶300；MyD88為1∶300；NF-κB為1∶200)4℃孵育過夜，次日洗片后，滴加即用型二抗工作液，37℃孵育1 h，DAB顯色10 min，蘇木素染色液復(fù)染，1%鹽酸乙醇分化后，中性樹膠封片，數(shù)碼顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取5個(gè)視野，測(cè)定平均光密度值，以均數(shù)作為該例大鼠目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1HE染色結(jié)果 正常組大鼠腎臟腎小球、腎小管、系膜結(jié)構(gòu)正常，間質(zhì)未見增寬，無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組大鼠腎臟腎小球囊腔變大，血管球萎縮，成纖維細(xì)胞增多，小管的管壁薄厚不勻，系膜細(xì)胞增生，腎小管上皮細(xì)胞彌漫空泡變性，大部分腎小管擴(kuò)張或者萎縮，基底膜增厚、斷裂，可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。腎衰飲組和尿毒清組大鼠腎臟系膜細(xì)胞增生減輕，成纖維細(xì)胞減少，腎小管上皮細(xì)胞空泡變性減輕，炎性細(xì)胞減少。見圖1。

2.2各組血清Scr、BUN水平 與正常組比較，模型組血清Scr、BUN水平明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，尿毒清組和腎衰飲組血清Scr、BUN水平均明顯降低(P<0.01)，尿毒清組和腎衰飲組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表1。

2.3各組血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平 與正常組相比，模型組血清IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，尿毒清組和腎衰飲組血清IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)水平均明顯降低(P<0.01)；與尿毒清組比較，腎衰飲組血清IL-6、TNF-α表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見表1。

圖1 各組腎臟組織病理形態(tài)(HE，×200)

表1 各組Scr、BUN水平及血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較

2.4Western印跡法檢測(cè)各組腎臟組織內(nèi)TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)水平 與正常組相比，模型組腎臟組織中TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，尿毒清組和腎衰飲組大鼠腎臟組織中TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P<0.01)，尿毒清組和腎衰飲組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見圖2、表2。

圖2 各組腎臟組織內(nèi)TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)

2.5免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組腎臟組織內(nèi)TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)情況 正常組腎臟組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)為陰性，模型組TLR4、MyD88、NF-κB蛋白呈強(qiáng)陽性表達(dá)，尿毒清顆粒和腎衰飲干預(yù)后均能不同程度的減少TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)(P<0.01)。見圖3～5、表3。

表2 各組大鼠腎臟組織內(nèi)TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)水平比較

圖3 各組TLR4蛋白表達(dá)(DAB，×200)

圖4 各組MyD88蛋白表達(dá)(DAB，×200)

圖5 各組NF-κB蛋白表達(dá)(DAB，×200)

表3 各組腎臟組織內(nèi)TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)比較

3 討 論

CRF與中醫(yī)文獻(xiàn)記載的“水腫”、“虛勞”、“關(guān)格”、“癃閉”、“溺毒”等疾病的病因和癥狀有一致和相似之處，主要病機(jī)特點(diǎn)為正虛邪實(shí)，正虛以脾腎虧虛為主，為發(fā)病之根本，邪實(shí)為內(nèi)生毒邪，主要是濕、痰、毒、瘀互結(jié)，是疾病加重的主要原因。西醫(yī)認(rèn)為CRF是各種慢性腎臟病持續(xù)進(jìn)展的共同結(jié)局〔7〕。CRF可因腎組織在多種因素的影響下，單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)被激活，巨噬細(xì)胞與腎臟固有細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)相互作用，產(chǎn)生多種炎癥因子，使腎臟處于慢性炎癥狀態(tài)中，腎臟固有細(xì)胞被破壞，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)聚積。而CRF過程中氧化應(yīng)激狀態(tài)被激活，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞被大量激活、中性粒細(xì)胞炎性浸潤(rùn)，產(chǎn)生大量促炎因子IL-1、IL-6、TNF-α等〔8〕，進(jìn)一步誘發(fā)炎癥反應(yīng)。微炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)被認(rèn)為是腎功能惡化的重要機(jī)制〔9〕。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為炎癥反應(yīng)是CRF發(fā)生的始動(dòng)因素。因此，抑制炎癥因子的表達(dá)，改善炎癥狀態(tài)，在一定程度上能夠延緩腎臟纖維化的進(jìn)程，延緩CRF進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)采用以腺嘌呤懸液灌胃法制作CRF大鼠模型，其機(jī)制是游離的腺嘌呤在黃嘌呤氧化酶的作用下生成尿酸，當(dāng)體內(nèi)尿酸濃度足夠大時(shí)，其結(jié)晶主要沉積在腎小管和腎間質(zhì)部位，引起腎小管阻塞及上皮細(xì)胞的萎縮或消失，周圍間質(zhì)可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肉芽腫形成且逐漸出現(xiàn)纖維化〔10〕。本文說明經(jīng)尿毒清顆粒及腎衰飲干預(yù)后大鼠炎癥反應(yīng)減輕，且腎衰飲的抗炎作用優(yōu)于尿毒清顆粒。免疫和炎癥因子在腎臟疾病的發(fā)病機(jī)制中起重要作用〔11，12〕。天然免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞，被認(rèn)為在介導(dǎo)腎臟炎癥和損傷方面有重要作用〔12〕。先天免疫細(xì)胞通過識(shí)別病原體相關(guān)分子模式(PAMPs,識(shí)別外來病原體，并被刺激分泌促炎細(xì)胞因子和趨化因子〔12，13〕)和損傷相關(guān)分子模式(DAMPs,識(shí)別組織損傷產(chǎn)生的內(nèi)源性配體)而發(fā)揮作用，其中DAMPs是腎臟先天免疫細(xì)胞活化和炎癥的重要誘因。TLRs表達(dá)在先天免疫細(xì)胞和腎臟固有細(xì)胞(如系膜和腎小管上皮細(xì)胞)上，并產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子和趨化因子，導(dǎo)致腎損傷〔13，14〕。目前認(rèn)為TLR2、TLR4、TLR9 被激活均可導(dǎo)致腎損傷。其中，TLR4被證明可表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等〔15，16〕。配體與TLR4結(jié)合，導(dǎo)致二聚和構(gòu)象改變，從而導(dǎo)致下游信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，下游信號(hào)的激活最終導(dǎo)致NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核并轉(zhuǎn)錄促炎癥靶基因，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。此過程需要受體蛋白的募集，包括MyD88、含銜接蛋白的TIR結(jié)構(gòu)域(TIRAP)、含銜接誘導(dǎo)干擾素的TIR結(jié)構(gòu)域(TRIF)和TRIF相關(guān)銜接分子(TRAM)?，F(xiàn)有研究〔17〕證明，主要有兩條TLR傳導(dǎo)途徑：①由MyD88銜接蛋白介導(dǎo)的MyD88信號(hào)通路; ②非依賴性MyD88信號(hào)通路。而依賴性MyD88途徑是TLR4的下游，該途徑導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，并傳播到下游的NF-κB，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子的激活〔18〕。有研究表明糖尿病腎病的炎癥過程中先天免疫系統(tǒng)被激活〔19，20〕。導(dǎo)致糖尿病腎病腎臟不可逆性纖維化和器官衰竭的始動(dòng)因素是炎癥〔21〕。在糖尿病患者的腎臟中信號(hào)通路NF-κB上調(diào)是已被認(rèn)可的重要的糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制〔22〕。本文結(jié)果說明TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路處于過度活化狀態(tài)，并且參與慢性腎功能衰竭的發(fā)生發(fā)展過程，腎衰飲可以抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路蛋白的表達(dá)，并且作用與尿毒清顆粒等同。

脾腎虧虛與毒邪互結(jié)是CRF整個(gè)病變過程發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵〔23〕。脾腎虧虛是本病發(fā)病的基礎(chǔ)，也是產(chǎn)生毒邪的根源，而毒邪亦是加重病情進(jìn)展惡化及遷延不愈的重要外因。馬曉燕教授依據(jù)CRF的發(fā)病機(jī)制及病機(jī)演變過程，提出了“抗毒、解毒、排毒”三法相結(jié)合的治療思想，運(yùn)用扶正與祛邪兼顧，健脾與補(bǔ)腎同治，重在健脾以抗毒，祛濕、化瘀以解毒，標(biāo)本兼顧，臨證施治，總結(jié)出經(jīng)驗(yàn)方腎衰飲。腎衰飲以黃芪、太子參、菟絲子益氣健脾補(bǔ)腎；茯苓、白術(shù)、半夏、砂仁健運(yùn)脾胃，調(diào)理升降，助腎命之氣以“抗毒”；白茅根、茯苓、藿香、佩蘭健脾祛濕排“濕毒”；鱉甲、丹參、莪術(shù)、水蛭、水紅花子活血化瘀以解“瘀毒”；大黃通腑瀉濁以“排毒”。本研究模型組大鼠升高的炎癥因子可被認(rèn)為中醫(yī)的毒邪，即“濁毒”“瘀血”等。因此，腎衰飲“抗毒”“解毒”“排毒”的治法可以等同于改善CRF的炎癥狀態(tài)。在臨床上尿毒清顆粒主要治療慢性腎功能衰竭早、中期的患者，對(duì)中醫(yī)辨證屬脾虛濕濁癥或脾虛兼血瘀癥者療效明顯，諸多實(shí)驗(yàn)和臨床研究均已證實(shí)其在治療慢性腎病的可行性。本研究證實(shí)腎衰飲在改善CRF大鼠腎臟功能方面作用與尿毒清顆粒是一致的，但在改善炎癥狀態(tài)方面腎衰飲優(yōu)于尿毒清顆粒。