nesfatin-1在胰島素抵抗骨骼肌細(xì)胞中對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的影響

王茜 李明澤 張晗 張琳 章瑩 程峣 袁燕 李思成 趙宇 廖鑫 高琳

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴州 遵義 563003)

研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病的癥狀是由于骨骼肌和脂肪細(xì)胞在最早階段胰島素信號(hào)傳導(dǎo)減弱使葡萄糖攝取減少導(dǎo)致攝取葡萄糖的能力受損所引起的〔1,2〕，而磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號(hào)通路是胰島素在葡萄糖代謝過程中最主要信號(hào)通路。新型飽食分子蛋白(nesfatin-1)作為一種新型的代謝調(diào)控因子，參與調(diào)節(jié)胰島素分泌，是一種葡萄糖反應(yīng)性的胰島素抵抗肽，可以通過外周的潛在作用調(diào)控葡萄糖穩(wěn)態(tài)和全身能量平衡在糖脂代謝和糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)展中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用〔3,4〕。nesfatin-1同胰島素可能存在協(xié)同作用，并具有類胰島素樣作用〔5〕。nesfatin-1的表達(dá)、分泌和(或)作用的功能障礙在與胰島素抵抗及胰島素信號(hào)通路相關(guān)的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用，但其是否是通過 PI3K/AKT 信號(hào)通路調(diào)節(jié)外周組織骨骼肌糖代謝及胰島素抵抗的研究未見報(bào)道。本研究通過前期構(gòu)建的骨骼肌細(xì)胞胰島素抵抗模型，體外給予腺病毒空載體、nesfatin-1過表達(dá)腺病毒載體，分析nesfatin-1表達(dá)變化對(duì)骨骼肌胰島素抵抗及對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路中下游指標(biāo)糖原合成酶激酶(GSK)-3β、 葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUT)-4的影響，初步探討nesfatin-1在胰島素抵抗骨骼肌PI3K/AKT信號(hào)通路中可能的分子機(jī)制，旨在為防治糖尿病及胰島素抵抗相關(guān)的代謝性疾病提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞與主要試劑 棕櫚酸(PA)溶于0.1 mol/L氫氧化鈉(NaOH)中，加入小牛血清白蛋白(BSA)，配制成10%BSA，5 mmol/L PA終濃度的母液，-20℃保存，以備后用。L6大鼠成肌細(xì)胞購自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、含乙二胺四乙酸(EDTA)的0.25%胰蛋白酶、青鏈霉素雙抗購自Gibco公司；PA購自Aladdin試劑(上海)有限公司；重組人胰島素(Insulin)購自Solarbio公司；含nesfatin-1基因的重組腺相關(guān)病毒載體及空載對(duì)照(PC)腺相關(guān)病毒載體由南京申基生物科技有限公司設(shè)計(jì)構(gòu)建；葡萄糖檢測(cè)試劑盒購自上海榮盛生物藥業(yè)有限公司；PI3K的催化亞基p110、磷酸化(p)-AKT(S473)、GSK-3β、GLUT4及內(nèi)參甘油醛-3磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體購自中國(guó)Proteintech公司。

1.2細(xì)胞分化及誘導(dǎo) 將復(fù)蘇后的 L6 細(xì)胞放入DMEM 培養(yǎng)基中，在適當(dāng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)到80%后更換為2%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基，待細(xì)胞逐漸行程規(guī)律性向同一邊生長(zhǎng)的狀態(tài)，梭形為主，呈現(xiàn)肌形結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)分化6～8 d，每2 d更換培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)，加入含 EDTA 的胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。

1.3建立胰島素抵抗模型 本研究團(tuán)隊(duì)前期將誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞分為4組，正常對(duì)照組(control組)內(nèi)加入不含胰島素的PA的緩沖液；PA 組加入250 μmol/L PA；Insulin 組加入100 nmol/L Insulin、 PA+Insulin 組加入250 μmol/L PA+100 nmol/L Insulin，待處理0 h、6 h、12 h、24 h后收集培養(yǎng)基上清，采用葡萄糖過氧化物酶方法測(cè)定上清液中葡萄糖含量，由于細(xì)胞上清液中葡萄糖含量越高代表胰島素抵抗越明顯，Insulin組與PA+Insulin組上清液葡萄糖含量在24 h時(shí)差值最大，提示胰島素抵抗效果逐漸明顯，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)處理時(shí)間選為24 h〔6〕。以此建立胰島素抵抗模型。

1.4細(xì)胞上清液葡萄糖含量檢測(cè) 將細(xì)胞通過離心、取沉淀、清洗、再離心、其沉淀、勻漿、孵育等過程，用分光光度計(jì)測(cè)定505 nm波長(zhǎng)處吸光度，每組3個(gè)樣本，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以此用葡萄糖過氧化物酶方法測(cè)定上清液中葡萄糖含量。

1.5L6細(xì)胞相關(guān)腺病毒感染及分組 取L6骨骼肌細(xì)胞均勻種植于12孔板，將過表達(dá)nesfatin-1和PC腺相關(guān)病毒原液1 μl加入細(xì)胞中，感染病毒約48 h后，將感染成功細(xì)胞分為空載對(duì)照腺相關(guān)病毒組(PC 組) 、PC+PA 組 、過表達(dá)nesfatin-1(OE)組和nesfatin-1+PA 組，各組均加入100 nmol/L Insulin，PC+PA 組和nesfatin-1+PA 組再加入250 μmol/L PA 處理24 h后收集培養(yǎng)基上清，采用葡萄糖過氧化物酶方法測(cè)定上清液中葡萄糖含量，用Western印跡檢測(cè)PI3K/AKT通路及其下游信號(hào)分子GSK-3β、GLUT-4的表達(dá)。

1.6Western印跡檢測(cè)細(xì)胞中相關(guān)分子的表達(dá) 將采用相關(guān)腺病毒感染處理后的L6 細(xì)胞加入RIPA 裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞全蛋白，檢測(cè)蛋白濃度。各組蛋白樣品經(jīng)10% 聚丙烯凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜封閉，一抗(1∶2 000)4℃過夜，二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h后，經(jīng)過TBST 洗4次，最后用電化學(xué)發(fā)光(ECL)系統(tǒng)進(jìn)行曝光檢件檢測(cè)蛋白條帶的灰度值，以目的條帶和內(nèi)參GAPDH條帶的比值作為蛋白表達(dá)水平。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1nesfatin-1過表達(dá)腺病毒的驗(yàn)證 OE組中nesfatin-1蛋白表達(dá)水平明顯高于PC組(2.67±0.31 vs 1.00±0.00，P<0.01)，nesfatin-1過表達(dá)腺病毒構(gòu)建成功。見圖1。

2.2過表達(dá)nesfatin-1對(duì)葡萄糖的影響 PC+PA組上清液中葡萄糖含量〔(140.05±2.37)mmol/L〕明顯高于PC組〔(122.40±2.93)mmol/L,P<0.05〕；OE組上清液中葡萄糖含量〔(100.00±3.02)mmol/L〕明顯低于PC 組(P<0.05)；nesfatin-1+PA組上清液中葡萄糖含量〔(132.26±2.37)mmol/L〕明顯低于PC+PA組(P<0.05)，nesfatin-1+PA組上清液中葡萄糖含量明顯高于OE組(P<0.05)。

圖1 Western印跡法檢測(cè)nesfatin-1蛋白表達(dá)水平

2.3過表達(dá)nesfatin對(duì)PI3K、p-AKT、GSK-3β、GLUT-4的影響 各組PI3K蛋白表達(dá)水平均無明顯區(qū)別(P>0.05)； 與PC組比較，PC+PA組p-AKT、GSK-3β、GLUT-4蛋白表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)；與PC組比較，OE組p-AKT、GSK-3β、GLUT-4蛋白表達(dá)水平明顯增高(P<0.05)；與PC+PA組相比，nesfatin-1+PA組p-AKT、GSK-3β、GLUT-4蛋白表達(dá)水平明顯增高(P<0.05)；與OE組相比，nesfatin-1+PA組p-AKT、GSK-3β、GLUT-4蛋白表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)。見圖2、表3。

圖2 過表達(dá)nesfatin對(duì)PI3K、pAKT、GSK-3β、GLUT-4的影響

表3 過表達(dá)nesfatin-1對(duì)PI3K、p-AKT、GSK3β、GLUT-4的影響

3 討 論

骨骼肌是機(jī)體攝取葡萄糖最主要的組織，研究表明，葡萄糖在骨骼肌中轉(zhuǎn)運(yùn)受損包括葡萄糖的傳遞、運(yùn)輸和磷酸化，這些過程所導(dǎo)致的細(xì)胞損傷過程是引起外周胰島素抵抗的重要原因〔7〕，因此，骨骼肌是肥胖和胰島素抵抗的重要部位〔8〕。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)到骨骼肌和脂肪細(xì)胞中的調(diào)節(jié)對(duì)于維持葡萄糖代謝和體內(nèi)平衡是至關(guān)重要的〔9〕，所以推測(cè)改善骨骼肌胰島素的敏感性可能是治療2型糖尿病的有效方法。

nesfatin-1是由下丘腦室旁核、視上核、弓狀核、下丘腦外側(cè)區(qū)和脊髓神經(jīng)元及外周組織(胰腺、肝臟、皮下和內(nèi)臟脂肪組織、褐色脂肪組織)和骨骼肌分泌，被認(rèn)為能影響體內(nèi)許多功能。nesfatin-1通過抑制食物攝入，對(duì)能量代謝產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，此外，它可作為一個(gè)神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)劑，調(diào)節(jié)心臟功能，降低血糖水平，并導(dǎo)致體重減輕，同時(shí)減少能量攝入〔10〕。2型糖尿病患者胰腺細(xì)胞中的nesfatin-1 mRNA的表達(dá)減少，妊娠糖尿病患者nesfatin-1也降低，在肥胖和糖尿病患者的中nesfatin-1的水平也明顯下降〔11～13〕，可以推測(cè)nesfatin-1與肥胖和胰島素抵抗可能存在一定的關(guān)系。Su等〔4〕通過外源注射nesfatin-1治療高血糖小鼠，結(jié)果顯示高血糖小鼠的血糖出現(xiàn)下降，證明nesfatin-1有降低血糖水平的作用。此外，Dore等〔14〕提出Nesfatin-1的降血糖作用是通過增加細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和通過提高胰島素敏感性抑制肝臟的葡萄糖異生作用介導(dǎo)的〔14〕，推測(cè)nesfatin-1是通過提高胰島素敏感性來改善2型糖尿病。證實(shí)nesfatin-1可增加骨骼肌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，減輕胰島素抵抗。

胰島素抵抗在2型糖尿病的發(fā)病和進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用，這種作用通常是由于胰島素信號(hào)通路減弱所引起〔15,16〕，而PI3K/AKT信號(hào)通路是胰島素作用的最主要信號(hào)通路。針對(duì)nesfatin-1對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的作用，Khalili等〔15〕證實(shí)，nesfatin-1可通過直接作用Ⅰ型鈣離子通道從而促進(jìn)葡萄糖刺激的細(xì)胞分泌胰島素。在相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，nesfatin-1可引起AKT磷酸化水平的增加，從而參與促進(jìn)肌肉細(xì)胞葡萄糖攝取和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)〔16〕。在喂食正常飼料的小鼠中，nesfatin-1可改善葡萄糖耐量，提高了AKT mRNA水平及骨骼肌中的磷酸化水平，在喂食高脂肪飲食小鼠中，nesfatin-1不僅能產(chǎn)生在喂食正常飼料小鼠中相同的作用，而且還抑制了食欲，提高了肝組織中的AKT水平〔17〕。中樞nesfatin-1可能通過激活胰島素受體(InsR)→InSr底物(IRS-1)→Akt信號(hào)通路級(jí)聯(lián)，促進(jìn)肌肉葡萄糖攝取，從而增加胰島素敏感性〔18〕。中樞nesfatin-1表達(dá)下調(diào)能夠明顯抑制普食喂養(yǎng)或高脂喂養(yǎng)的大鼠肝臟AKT 磷酸化水平，推測(cè)中樞nesfatin-1的抑制可能是通過抑制InsR/IRS-1/AKT 胰島素信號(hào)作用通路從而促進(jìn)機(jī)體胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展〔19〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了上調(diào)nesfatin-1不僅能改善骨骼肌胰島素抵抗，而且這種作用可能是通過上調(diào)AKT磷酸化水平而完成。

GLUT-4是AKT的重要底物，是一種胰島素調(diào)節(jié)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，主要存在于脂肪、骨骼或心臟組織中〔20〕。在骨骼肌中，發(fā)展胰島素抵抗和2型糖尿病的早期步驟是GLUT-4表達(dá)和易位的減少〔21〕，而PI3K/AKT信號(hào)通路在胰島素刺激的GLUT-4易位中起關(guān)鍵作用，并且該級(jí)聯(lián)的損傷導(dǎo)致胰島素誘導(dǎo)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)至肌細(xì)胞的數(shù)量減少，進(jìn)而導(dǎo)致胰島素抵抗和2型糖尿病〔22〕。GLUT-4的表達(dá)失調(diào)或功能受損可引起胰島素抵抗，所以GLUT-4被認(rèn)為是2型糖尿病的潛在治療靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在存在胰島素抵抗的骨骼肌細(xì)胞中，通過過表達(dá)nesfatin-1，發(fā)現(xiàn)不僅AKT磷酸化水平增高，而且AKT底物GLUT-4亦出現(xiàn)增高，推測(cè)nesfatin-1對(duì)胰島素抵抗及血糖的調(diào)節(jié)可能是通過上調(diào)AKT的磷酸化及GLUT-4的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。有學(xué)者認(rèn)為nesfatin-1對(duì)葡萄糖代謝的影響與AKT和GLUT-4有關(guān)〔19〕，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之相一致。在PI3K/AKT信號(hào)通路下游的GSK-3β是調(diào)節(jié)糖原合成的重要底物，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦證實(shí)，過表達(dá)nesfatin-1均可上調(diào)p-AKT及下游的GSK-3β的表達(dá)，由此可以推測(cè)，GSK-3β可能是nesfatin-1改善骨骼肌細(xì)胞胰島素抵抗作用的一個(gè)靶點(diǎn)。

但是本實(shí)驗(yàn)對(duì)PI3K蛋白的檢測(cè)各組間均無明顯差異，考慮nesfatin-1可能對(duì)PI3K/AKT通路的影響是直接激活A(yù)kt及下游底物GLUT4和GSK-3β，對(duì)上游的PI3K無作用。而且本實(shí)驗(yàn)只采用了nesfatin-1過表達(dá)腺病毒載體，未使用nesfatin-1表達(dá)抑制腺病毒載體，存在部分缺陷，所以本研究團(tuán)隊(duì)接下來將進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)染nesfatin-1表達(dá)抑制腺病毒載體，并使用該通路的激動(dòng)劑及抑制劑，更全面的研究其與該通路的關(guān)系。

綜上所述，過表達(dá)nesfatin-1可顯著增加細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，減輕胰島素抵抗，同時(shí)能夠刺激Akt磷酸化，上調(diào)下游糖代謝相關(guān)的GSK-3β、GLUT-4的表達(dá)。