清腦益元湯對(duì)大鼠腦缺血損傷Nestin、NGF表達(dá)的影響

俞睿 祝美珍 劉倩菁 向昱臻 蘇萍 韋亮 孫詩(shī)杰

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200)

缺血性腦血管疾病作為臨床常見(jiàn)病和多發(fā)病，其發(fā)病年齡逐漸呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)，已成為威脅人類(lèi)健康與生命的重要疾病之一。目前臨床上主要采用溶栓、降纖和神經(jīng)保護(hù)等治療手段，但受制于其嚴(yán)格的時(shí)間窗和適應(yīng)、禁忌證要求，預(yù)后效果并不理想。如何有效提高缺血性腦血管疾病治療效果、改善患者遺留的后遺癥是醫(yī)學(xué)界長(zhǎng)期研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血損傷可誘導(dǎo)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，巢蛋白 (Nestin) 作為神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)的標(biāo)記物，已廣泛應(yīng)用于NSC的鑒定，其在腦組織損傷中的表達(dá)規(guī)律與NSC增殖及凋亡存在密切關(guān)聯(lián)性〔1〕。而神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF) 作為神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族(NTF) 中重要的細(xì)胞因子，在腦缺血損傷后，對(duì)神經(jīng)元起到修復(fù)作用，可改善神經(jīng)元的病理狀態(tài)。已有研究證實(shí)〔2，3〕，通過(guò)增加腦缺血損傷中的Nestin、NGF蛋白表達(dá)水平，能有效可促進(jìn)神經(jīng)元的再生，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡。近年來(lái)由于中藥復(fù)方多靶點(diǎn)、多途徑的優(yōu)勢(shì)與特點(diǎn)在預(yù)防和治療缺血性腦血管疾病方面取得了顯著成效。根據(jù)“祛瘀生新，精成髓生”理論而譴藥組方的清腦益元湯，經(jīng)前期臨床和實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)有較好的治療效果。因此，本研究基于前期研究基礎(chǔ)上通過(guò)觀察清腦益元湯對(duì)腦缺血損傷性大鼠Nestin、NGF表達(dá)水平的影響，試圖進(jìn)一步探明清腦益元湯防治缺血性腦血管病的作用機(jī)制，為清腦益元湯防治腦缺血損傷提供新的思路與方法。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年健康SPF級(jí)雄性SD大鼠192只，體重(250±50)g，均購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK桂2014-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK桂2014-0003)。飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，常規(guī)自由飲食飲水飼養(yǎng)。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物 清腦益元湯：水牛角30 g、水蛭8 g、肉蓯蓉10 g、赤芍15 g、參三七10 g、川牛膝15 g、紫河車(chē)15 g、紅景天20 g、干地黃10 g、制首烏10 g，以上所用藥材均由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院購(gòu)入。

1.3實(shí)驗(yàn)設(shè)備與試劑 手動(dòng)輪轉(zhuǎn)石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)、-80℃超低溫冰箱(海爾公司)、蔡司顯微鏡(德國(guó)Zeiss公司)、高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)、全自動(dòng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(LightCycler96)、Nestin單克隆抗體(英國(guó)abcam公司，生產(chǎn)批號(hào)：GR3234309-2)、NGF單克隆抗體(英國(guó)abcam公司，生產(chǎn)批號(hào)：GR226375-44)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京天根生物科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：R6424)、擴(kuò)增試劑盒(北京天根生物科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：R6306)、Nestin、NGF引物及內(nèi)參 (上海生工股份有限公司提供) 。

1.4方法

1.4.1動(dòng)物分組 將192只成年健康雄性SD大鼠按體重依次編號(hào)，用隨機(jī)數(shù)字表將大鼠分為兩大組，每大組再分為四小組即空白組(6只)、假手術(shù)組(30只)、模型組(30只)、清腦益元組(30只)。除空白組外，假手術(shù)組、模型組和清腦益元湯組分別按術(shù)后取材時(shí)間點(diǎn)分為1 d、3 d、7 d、14 d、28 d 5個(gè)亞組，5個(gè)亞組每組6只。

1.4.2動(dòng)物造模 適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，空白組正常喂養(yǎng)，假手術(shù)組線栓插入大鼠右側(cè)頸總動(dòng)脈(0.8±0.2)cm，此深度不足以阻斷大腦中動(dòng)脈血流，模型組及清腦益元湯組參考Longa等〔4〕法制備大鼠大腦中動(dòng)脈梗死模型(MCAO)，制成大鼠急性腦缺血損傷模型。

1.4.3給藥 參照賀氏劑量-體表面積換算法〔5〕，以體重60 kg成人每天服用清腦益元湯，參考文獻(xiàn)〔6〕中的標(biāo)準(zhǔn)方程進(jìn)行換算，按體量14 ml/kg進(jìn)行灌胃，為達(dá)到血藥濃度，預(yù)灌藥7 d，分別于每日上午9∶00～10∶00及下午16∶00～17∶00時(shí)進(jìn)行灌胃，空白組、假手術(shù)組、模型組予蒸餾水灌胃，清腦益元組予清腦益元湯灌胃，藥物濃度含生藥材2 g/ml，直至按各時(shí)間點(diǎn)取材。

1.5標(biāo)本采集及處理 用10%水合氯醛按35 mg/kg經(jīng)腹腔注射麻醉鼠后，固定大鼠，用組織剪在大鼠胸骨下沿雙側(cè)肋骨走行方向打開(kāi)胸腔，充分暴露心臟、肝臟，剪開(kāi)右心耳，同時(shí)用穿刺針小心插入大鼠左心尖部并用止血鉗固定，快速注入0.9%氯化鈉約200 ml，灌注至大鼠全身血色變淺、變白、四肢抽搐，接著灌注4%的多聚甲醛300 ml，見(jiàn)肺臟、肝臟變蒼白色，全身變僵硬，提示灌注成功。灌注完成后，用組織剪從頸部剪開(kāi)皮膚后，用止血鉗尖從腦囟門(mén)后輕微插入，咬去顱骨，充分暴露大腦后，用鑷子的尾部剝?nèi)〕龃竽X，分別放入液氮罐中(Real-Time PCR)和組織固定液中(免疫組化)。

1.6指標(biāo)檢測(cè)

1.6.1采用免疫組化法檢測(cè)大鼠腦缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)Nestin、NGF表達(dá) 嚴(yán)格按照通用二步法試劑盒操作，用顯微鏡10×視野進(jìn)行觀察整體陽(yáng)性表達(dá)情況，再取40×視野進(jìn)行拍照。運(yùn)用Image圖像分析軟件對(duì)缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)Nestin、NGF陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，取其平均值。

1.6.2采用Real-Time PCR法檢測(cè)大鼠腦缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)Nestin、NGFmRNA的表達(dá) 提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：預(yù)變性95℃、15 min；采用二步法進(jìn)行擴(kuò)增，變性95℃、10 s；退火/延伸60℃、32 s；共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；選擇SYBR GreenⅠ法，點(diǎn)擊開(kāi)始反應(yīng)，結(jié)束后得到擴(kuò)增曲線、溶解曲線和Ct值。引物序列見(jiàn)表1。

表1 基因引物序列

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS24.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1清腦益元湯對(duì)大鼠腦缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)Nestin表達(dá)的影響 Nestin在大鼠腦組織缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)陽(yáng)性反應(yīng)物主要位于胞質(zhì)，呈棕黃色或深棕褐色?？瞻捉M、假手術(shù)組可見(jiàn)少量Nestin陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)，兩組在各時(shí)間點(diǎn)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在相同時(shí)間點(diǎn)與假手術(shù)組比較，模型組、清腦益元組Nestin的陽(yáng)性細(xì)胞明顯升高(P<0.01)；模型組、清腦益元組Nestin陽(yáng)性細(xì)胞在缺血1 d表達(dá)開(kāi)始升高，3 d后達(dá)高峰，且隨腦缺血損傷時(shí)間延長(zhǎng)其表達(dá)逐漸下降；與模型組在同一時(shí)間點(diǎn)相比，清腦益元組Nestin陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯升高(P<0.01)。見(jiàn)表2，圖1。

2.2清腦益元湯對(duì)大鼠腦缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)NGF表達(dá)的影響 NGF在大鼠腦組織缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)免疫陽(yáng)性反應(yīng)物主要位于胞質(zhì)和突起內(nèi)，呈棕黃色顆粒。在相同時(shí)間點(diǎn)各組間比較，與空白組比較，假手術(shù)組NGF陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與假手術(shù)組相比，模型組、清腦益元湯組NGF陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)升高有顯著差異(P<0.01)；模型組、清腦益元湯組NGF陽(yáng)性細(xì)胞在缺血1、3 d開(kāi)始增強(qiáng)，7 d達(dá)到最高峰，14 d后呈逐步降低的趨勢(shì)；與模型組相比，清腦益元湯組NGF陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2，表3。

2.3Real-Time PCR檢測(cè)大鼠腦缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)Nestin mRNA的表達(dá) 在相同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，與空白組相比，假手術(shù)組大鼠腦組織缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)Nestin mRNA的表達(dá)量無(wú)顯著差異(P>0.05)；與假手術(shù)組相比，模型組、清腦益元湯組Nestin mRNA表達(dá)量顯著增加(P<0.01)；模型組、清腦益元組Nestin mRNA表達(dá)在缺血1 d表達(dá)開(kāi)始升高，3 d后達(dá)高峰，且隨腦缺血損傷時(shí)間延長(zhǎng)其表達(dá)逐漸下降；與模型組相比，清腦益元湯組Nestin mRNA表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表4。

表2 各時(shí)間點(diǎn)Nestin陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)個(gè)/視野)

圖1 各組缺血不同時(shí)間點(diǎn)Nestin陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)結(jié)果(×40)

圖2 各組缺血不同時(shí)間點(diǎn)NGF陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)(×40)

表3 缺血各時(shí)間點(diǎn)NGF陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)個(gè)/視野)

表4 缺血各時(shí)間大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)Nestin mRNA的表達(dá)

2.4Real-Time PCR檢測(cè)大鼠腦缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)NGF mRNA的表達(dá) 在相同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，與空白組相比，假手術(shù)組大鼠腦組織缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)NGF mRNA的表達(dá)量無(wú)差異(P>0.05)；與假手術(shù)組相比，模型組、清腦益元湯組NGF mRNA表達(dá)量顯著增加(P<0.01)；模型組、清腦益元湯組NGF陽(yáng)性細(xì)胞在缺血1、3 d開(kāi)始增強(qiáng)，7 d達(dá)到最高峰，14 d后呈逐步降低的趨勢(shì)；與模型組相比，清腦益元湯組NGF mRNA表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 缺血各時(shí)點(diǎn)大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)NGF mRNA的表達(dá)

3 討 論

3.1腦缺血損傷與Nestin及NGF的關(guān)系 Nestin是一種在胚胎NSC呈一過(guò)性表達(dá)的中間絲蛋白，具有維持神經(jīng)前體細(xì)胞正常形態(tài)的功能，隨著分化、增殖和遷移的神經(jīng)細(xì)胞不斷發(fā)育成熟，Nestin表達(dá)強(qiáng)度會(huì)逐漸減弱甚至消失，并逐漸被其他中間絲蛋白所代替。Nestin主要存在于胚胎發(fā)生期的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，被認(rèn)為是神經(jīng)前體細(xì)胞或NSC的特異性標(biāo)記物之一〔7〕。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，在腦缺血損傷早期可誘導(dǎo)Nestin的表達(dá)，而在腦缺血損傷最嚴(yán)重的區(qū)域表達(dá)最為明顯。Nestin作為NSC的特異性標(biāo)記蛋白，可誘導(dǎo)內(nèi)源性NSC的增殖，并實(shí)現(xiàn)自我更新，在腦缺血損傷后，Nestin在對(duì)受損的腦組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行修復(fù)和重塑以及在腦損傷區(qū)域高表達(dá)都預(yù)示了Nestin的激活。郭云良等〔8〕研究發(fā)現(xiàn)，在腦缺血灌注損傷后，Nestin在皮質(zhì)區(qū)和紋狀體區(qū)在1 d、7 d出現(xiàn)高表達(dá)，隨后逐漸降低，結(jié)果提示Nestin具有促進(jìn)NSC增殖的作用，并參與了損傷后腦組織的修復(fù)過(guò)程。NGF作為NTF之一，對(duì)神經(jīng)元的增殖、分化、存活和功能維持起到調(diào)控作用〔9〕，在病理情況下，NGF可以促進(jìn)腦缺血后NSC增殖，抑制神經(jīng)元發(fā)生凋亡，從而對(duì)受損的神經(jīng)元起到全面而持久的保護(hù)作用。王亞軍等〔10〕通過(guò)子午流注針?lè)▽?duì)腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ瓦M(jìn)行干預(yù)研究發(fā)現(xiàn)，在腦缺血損傷后，針刺組NGF在6 h開(kāi)始增高，7 d時(shí)達(dá)到最高峰，14 d后逐漸下降，但21 d時(shí)仍高于模型組，結(jié)果表明針刺可以上調(diào)腦內(nèi)神經(jīng)因子NGF表達(dá)，改善神經(jīng)元細(xì)胞生存的微環(huán)境，促進(jìn)腦缺血后NSC的增殖，減輕腦損傷，從而發(fā)揮腦保護(hù)作用。

3.2清腦益元湯對(duì)腦缺損傷Nestin及NGF的影響 缺血性腦卒中多好發(fā)于中老年人，中醫(yī)認(rèn)為缺血性腦卒中是各種致病因素相互作用，阻塞脈絡(luò)，填塞清竅所致，其總的病機(jī)是本虛標(biāo)實(shí)?！梆?、熱、毒、髓”是缺血性腦卒中的重要病機(jī)，因而在對(duì)缺血性腦卒中的治療上，要從“血瘀→瘀熱→瘀毒→髓傷”這一整體病機(jī)關(guān)聯(lián)著手，深入探索清腦益元湯阻斷腦缺血損傷“缺血-炎癥-水腫-凋亡”的連鎖效應(yīng)〔11〕，在清熱祛瘀的同時(shí)，要補(bǔ)腎益元生髓，標(biāo)本兼治改善腦內(nèi)環(huán)境。前期我們研究發(fā)現(xiàn)〔12〕，清腦益元湯能夠有效抑制腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-8陽(yáng)性細(xì)胞的過(guò)度表達(dá)，阻斷腦缺血損傷的炎癥連鎖反應(yīng)，使腦脈通暢而達(dá)到防治效果。此外，臨床結(jié)果表明〔13〕，清腦益元湯能減輕缺血性腦卒中患者急性期神經(jīng)功能缺損程度，提高臨床療效。清腦益元湯是立足于缺血性腦卒中病因病機(jī)的基本特點(diǎn)，深入剖析“腎”“腦”之間的關(guān)聯(lián)性，根據(jù)“祛瘀生新，精成髓生”理論，扶正祛邪的治療法則而立法處方，同時(shí)又充分體現(xiàn)了中醫(yī) “病在上者下取之”的整體思想。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，清腦益元湯可能通過(guò)上調(diào)腦內(nèi)神經(jīng)元Nestin、NGF蛋白及mRNA表達(dá)水平，從而參與腦缺血的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞增殖，減輕腦缺血損傷，從而發(fā)揮腦保護(hù)作用，與相關(guān)報(bào)道研究一致〔14，15〕。推測(cè)清腦益元湯在發(fā)揮腦保護(hù)的作用機(jī)制主要有兩方面：(1)在腦缺血發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，清腦益元湯能有效及時(shí)阻止神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，從而減輕腦損傷；(2)在清腦益元湯組方中含有清熱祛瘀、補(bǔ)腎益精之藥，易能在清熱解毒、活血祛瘀之時(shí)，又能起到補(bǔ)腎益元生髓的效果，能有效促進(jìn)腦缺血損傷后神經(jīng)元修復(fù)，進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖，達(dá)到腦保護(hù)作用。