4，4’-二甲氧基查耳酮改善高脂飼養(yǎng)小鼠的胰島素敏感性

張偉虹，趙 微，李春美，解相宏，姚 紅*，劉曉軍*

(1.山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，山西 太原 030001； 2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100005)

肥胖(obesity)是一種常見的慢性代謝性疾病，會(huì)引起與肥胖相關(guān)的多種代謝綜合征，對(duì)人們健康造成嚴(yán)重危害。肥胖者體內(nèi)由于大量脂質(zhì)的儲(chǔ)存使脂肪細(xì)胞體積增大，影響脂肪細(xì)胞正常的生理代謝。脂肪組織不僅有儲(chǔ)存脂肪的作用，而且是一種免疫器官。脂肪組織內(nèi)含有大量的免疫細(xì)胞，可以分泌多種生物活性物質(zhì)。脂肪組織發(fā)生炎性反應(yīng)時(shí)可出現(xiàn)大量的促炎性或炎性介質(zhì)過表達(dá)，細(xì)胞因子合成異常，脂肪組織內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤等[1]。

黃酮類化合物在植物中廣泛存在，具有抗感染、抗氧化、抗心腦血管和抗腫瘤等多種作用，這一點(diǎn)已被國內(nèi)外學(xué)者通過大量實(shí)驗(yàn)研究得到充分證實(shí)[2-4]。4，4’-二甲氧基查耳酮(4, 4’-dimethoxy chalcone, DMC)屬于黃酮類化合物的一種。最新研究表明，DMC外用可延長酵母、蠕蟲和蒼蠅的壽命，減緩培養(yǎng)的人體細(xì)胞衰老，保護(hù)小鼠心肌缺血時(shí)間延長，誘導(dǎo)自噬[5]。但是對(duì)于DMC在炎性反應(yīng)與代謝調(diào)節(jié)中的功能作用，目前尚不清楚。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)野生型C57/BL6雄鼠，體質(zhì)量20～25 g，(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，No.1103241911032517)。所有的實(shí)驗(yàn)程序遵照中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物倫理要求操作。

1.1.2 主要試劑：4, 4’-二甲氧基查耳酮(Sigma-Aldrich公司)；葡萄糖和丙酮酸鈉(Thermo Fisher Scientificals公司)；兔抗小鼠F4/80和山羊抗兔F4/80(武漢賽維爾生物科技有限公司)；二甲基亞砜(DMSO)、胰島素和蘇木精染液(上海碧云天生物技術(shù)公司)；OCT包埋劑 (Sakura公司)；高脂飼料(Research Diets NB,USA)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠的分組及處理：將小鼠分為對(duì)照組(腹腔注射DMSO,n=10)和實(shí)驗(yàn)組(腹腔注射藥物DMC,n=11)每隔1 d按3 μg/kg腹腔注射藥物DMC和溶劑DMSO。給藥前先稱量兩組小鼠的體質(zhì)量，計(jì)算給藥體積。每周定時(shí)檢測兩組小鼠體質(zhì)量和攝食量。

1.2.2 葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(glucose tolerance test,GTT)、丙酮酸鈉耐量實(shí)驗(yàn)(sodium pyruvate tolerance test,PTT)和胰島素耐量實(shí)驗(yàn)(insulin tolerance test,ITT)：在進(jìn)行GTT、PTT實(shí)驗(yàn)前需小鼠禁食12～16 h，在ITT實(shí)驗(yàn)前需禁食4 h左右。先用剪刀剪取小鼠尾部末端，取適量血測定小鼠初始血糖值，之后分別給小鼠腹腔注射葡萄糖溶液(2.7 g葡萄糖定容到10 mL PBS溶液)、丙酮酸鈉溶液(0.625 g 丙酮酸鈉加入5 mL PBS溶液)和胰島素溶液(2 mg/mL胰島素母液，吸取10 μL母液加入10 mL磷酸鹽緩沖液，現(xiàn)用現(xiàn)配)。注射量(μL)=小鼠體質(zhì)量(g)×6，注射完畢后立刻開始計(jì)時(shí)，在第30、60、90和120 min各時(shí)間點(diǎn)尾部取血，用血糖儀測定相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的血糖值并作記錄。

1.2.3 稱重比較兩組脂肪組織：本實(shí)驗(yàn)結(jié)束準(zhǔn)備取材時(shí)，饑餓小鼠6～8 h，電子天平稱量小鼠體質(zhì)量，注射一定量的麻醉藥，進(jìn)行眼球取血，將血液收集于1.5 mL離心管，做好標(biāo)記。然后使用眼科刀打開小鼠腹腔，摘取腹股溝及性腺處白色脂肪組織和背部處棕色脂肪組織，進(jìn)行稱重并分裝保存。

1.2.4 附睪脂肪組織(epididymal white adipose tissues, eWAT)的HE染色：具體實(shí)驗(yàn)操作參考文獻(xiàn)[6]，顯微鏡觀察脂肪組織形態(tài)學(xué)變化。

1.2.5 免疫組化檢測附睪脂肪組織(eWAT)：具體實(shí)驗(yàn)操作參考文獻(xiàn)[6]，顯微鏡觀察脂肪組織形態(tài)學(xué)變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 DMC并不影響小鼠的體質(zhì)量和食物攝取

與對(duì)照組小鼠相比，DMC實(shí)驗(yàn)組小鼠在給藥后體質(zhì)量及進(jìn)食差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (圖1)。

2.2 DMC改善高脂飼養(yǎng)小鼠的胰島素敏感性

與對(duì)照組相比，DMC藥物組明顯改善小鼠胰島素敏感性(ITT) (P<0.05) (圖2A)。葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(GTT)和丙酮酸鈉耐量實(shí)驗(yàn)(PTT)在兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2B，C)。

A.growth of DMC mice and control(CON) mice were weighed; B.food intake of DMC mice and control mice圖1 DMC組和對(duì)照組小鼠體質(zhì)量及進(jìn)食變化Fig 1 Body weight and food intake of mice in DMC and control

ITT(A), GTT(B) and PTT(C) were performed in 10～11-week-old DMC mice and control(CON) mice at the indicated time points (left); the area under the curve (AUC) for the ITT, GTT and PTT was shown(right); *P<0.05 compared witn control group圖2 ITT、GTT和PTT實(shí)驗(yàn)Fig 2 Experiment of ITT, GTT and

2.3 DMC減少脂肪組織巨噬細(xì)胞的浸潤

對(duì)照組和DMC實(shí)驗(yàn)組小鼠的附睪脂肪組織(eWAT)、皮下脂肪組織(inguinal white adipose tissues, iWAT)和棕色脂肪組織(brown adipose tissues, BAT) 3者的體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3A)；脂肪組織/體質(zhì)量比值無差異(圖3B)。附睪脂肪組織HE染色可觀察到：與對(duì)照組相比較，DMC實(shí)驗(yàn)組脂肪細(xì)胞間的炎性細(xì)胞浸潤減少(圖4)。作為巨噬細(xì)胞的特異性表達(dá)抗原，F(xiàn)4/80可以鑒別出巨噬細(xì)胞與其他脂肪組織間質(zhì)細(xì)胞。附睪脂肪組織免疫組化F4/80染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，DMC實(shí)驗(yàn)組脂肪細(xì)胞間的巨噬細(xì)胞浸潤減少(圖5)。

A.the weight of eWAT, iWAT and BAT in DMC mice and control(CON) mice; B.the ratio of eWAT, iWAT and BAT/body weight in DMC mice and control mice圖3 3種脂肪組織及與體質(zhì)量比值情況Fig 3 Three types of adipose tissue and their ratio to body

圖4 附睪脂肪組織HE染色Fig 4 HE staining of epididymal adipose tissue(×40)

圖5 附睪脂肪組織F4/80免疫組化染色Fig 5 F4/80 immunohistochemical staining of epididymal adipose tissue(×40)

3 討論

肥胖是一種代謝相關(guān)的炎性反應(yīng)性疾病，且常引起各種代謝綜合征。在這些代謝綜合征中，最密切相關(guān)的一點(diǎn)就是胰島素抵抗[7]。胰島素作為機(jī)體內(nèi)唯一降低血糖的激素，對(duì)調(diào)控機(jī)體正常能量代謝具有重要作用。

傳統(tǒng)上認(rèn)為研究肥胖和飲食誘導(dǎo)的相關(guān)代謝綜合征的靶器官是脂肪組織。脂肪組織中炎性反應(yīng)的持續(xù)存在是肥胖及相關(guān)代謝并發(fā)癥發(fā)生的主要原因。正常機(jī)體脂肪組織中的免疫細(xì)胞通過分泌IL-4和IL-13等2型細(xì)胞因子，使脂肪組織巨噬細(xì)胞處于M2型抗炎(抗感染)狀態(tài)。但在肥胖狀態(tài)下，脂肪組織肥大就會(huì)引起脂肪細(xì)胞表面炎性介質(zhì)表達(dá)上調(diào)，從而促使NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞分泌大量IFN-γ (γ干擾素)，IFN-γ能驅(qū)動(dòng)脂肪組織巨噬細(xì)胞向M1型轉(zhuǎn)化促進(jìn)炎性反應(yīng)[8]。與以上結(jié)論相一致的是，研究發(fā)現(xiàn)脂肪細(xì)胞分泌的miR-34a可以抑制脂肪巨噬細(xì)胞從促炎M1向抗炎(抗感染)M2表型的轉(zhuǎn)換，從而促進(jìn)肥胖誘導(dǎo)的脂肪炎性反應(yīng)[9]。研究顯示，肥胖者的脂肪細(xì)胞周圍有大量巨噬細(xì)胞浸潤，甚至這些巨噬細(xì)胞可互相融合形成巨大的多核細(xì)胞，而正常體質(zhì)量者的脂肪細(xì)胞則沒有這種現(xiàn)象發(fā)生[10]。巨噬細(xì)胞可通過不同的作用機(jī)制在脂肪組織內(nèi)集聚，比如單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)和C-C趨化因子受體2(CCR2)可使脂肪組織內(nèi)發(fā)生大量巨噬細(xì)胞集聚。脂肪組織細(xì)胞外脂質(zhì)濃度的增加是脂肪組織巨噬細(xì)胞積累的最終機(jī)制。此外，由肥胖引起的缺氧和高濃度游離脂肪酸會(huì)加劇巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)，脂肪細(xì)胞的能量代謝狀態(tài)是巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)輸出的主要因素[11]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DMC對(duì)高脂飼養(yǎng)小鼠的胰島素抵抗有顯著改善作用。DMC通過清除或有效抑制脂肪組織內(nèi)巨噬細(xì)胞的積累，改善高脂飲食所引起的胰島素抵抗，在一定程度上緩解了肥胖相關(guān)的代謝綜合征，為肥胖及相關(guān)代謝綜合征的治療提供了理論基礎(chǔ)。通過藥物特異性阻止脂肪組織對(duì)炎性細(xì)胞的招募，可能是研究治療肥胖的一個(gè)新方向。未來將進(jìn)一步明確DMC抑制脂肪組織巨噬細(xì)胞蓄積和改善胰島素敏感性的分子機(jī)制作用，并探究其相關(guān)的毒理性作用。