煙酸姜黃素酯抑制LPS誘導的HUVECs分泌炎性細胞因子與內質網(wǎng)應激

李招兵，馬小峰，江振濤，黃云輝

(南華大學附屬南華醫(yī)院 心內科， 湖南 衡陽 421001)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis)是一種以血管內皮功能障礙、血管炎性反應以及脂質、膽固醇和鈣在血管壁內膜的積聚為特征的大中型肌動脈疾病。其發(fā)病機制復雜，涉及到內皮、巨噬細胞和平滑肌細胞之間復雜的相互作用[1]。姜黃素(curcumin)是一種從姜黃中分離出來的疏水性多酚，對心血管系統(tǒng)具有一定的保護作用[2]。但其水溶性差，生物利用度較低。相比之下，其衍生物煙酸姜黃素酯(nicotinate-curcumin，NC)具有更好的水溶性和溶液穩(wěn)定性，能調節(jié)載脂蛋白E缺陷(ApoE-/-)小鼠的脂質代謝，并能抑制泡沫細胞形成[3-4]，然而其確切機制仍然不清楚。

磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activate protein kinase，AMPK)是一種參與維持細胞穩(wěn)態(tài)的激酶，廣泛表達于血管內皮細胞內，在維持血管內皮細胞的穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用[5]。如AMPK能抑制血管內皮細胞中NF-κB的激活，并能減少TNF-α的分泌，減輕ApoE缺陷小鼠動脈損傷而減輕動脈粥樣硬化[6-7]。盡管NC已被證明具有抗感染特性，但其對心血管疾病的作用尚不完全明確。本研究旨在探討NC對動脈粥樣硬化形成的影響及其分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑及試劑盒：煙酸姜黃素酯(南華大學藥物藥理研究所，純度﹥98%)；脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)(Sigma-Aldrich公司)；BCECF/AM熒光染料、LipofectamineTMRNAiMAX試劑(Invitrogen公司)；磷酸化AMPK(Thr172；1︰1 000)、抗-AMPK、抗-磷酸化NFκB p65和抗-NF-κB p65抗體(Cell Signaling Technology公司)；抗-ICAM-1、抗-VCAM-1、抗-E-選擇素、抗-磷-eIF2α、抗-eIF2α、抗-磷-IRE-1、抗-IRE-1、抗-CHOP和抗-β-actin抗體(Santa Cruz公司)；硝酸纖維素膜、化學發(fā)光試劑盒(Amersham公司)； TNF-α和IL-6 ELISA試劑盒(R&D公司)；過氧化氫試劑盒(Abcam公司)。

1.1.2 細胞：人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC，ATCC公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養(yǎng)及分組處理：用含10%胎牛血清、鏈霉素(100 U/μL)和青霉素(100 U/μL)的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2和95%濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HUVECs。約每2 d更換次培養(yǎng)基。傳代時用胰蛋白酶-EDTA(0.05 g/L胰蛋白酶，0.02 g/L EDTA)分離匯合細胞，細胞培養(yǎng)至第3～7代后用于下一步研究。

1.2.2 Western blot檢測蛋白表達或磷酸化： 收集處理后細胞，用裂解緩沖液在4 ℃下裂解60 min以提取細胞總蛋白。將蛋白質樣品(35 μg)經(jīng)12% SDS-PAGE分離后，電轉至硝酸纖維素膜上，經(jīng)封閉后，加入相應的一抗4 ℃孵育過夜，充分洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育30 min。最后采用使用化學發(fā)光法進行顯影。

1.2.3 RNA干擾實驗： 根據(jù)試劑盒的說明書，將AMPK siRNA或對照siRNA(20 nmol/L)轉染至HUVECs。簡言之，將1×105個細胞接種于6孔板中，用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜后加入轉染混合物，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后換用新鮮培養(yǎng)基，細胞在37 ℃培養(yǎng)過夜。

1.2.4 細胞黏附的實驗： 用LPS(200 ng/mL)和NC(20 μmol/L)處理HUVECs 24 h，然后與BCECF/AM熒光探針標記的單核巨噬細胞THP-1共培養(yǎng)。1 h后，用磷酸緩沖鹽溶液PBS漂洗3次后，熒光顯微鏡下計數(shù)。

1.2.5 ELISA檢測TNF-α和IL-6的水平： 將接種于24孔板中的HUVECs細胞經(jīng)藥物處理后，收集每孔培養(yǎng)基上清，根據(jù)試劑盒的說明，用人TNF-α和IL-6 ELISA試劑盒測定上清液中TNF-α和IL-6的水平。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 煙酸姜黃素酯經(jīng)AMPK途徑抑制LPS激活HUVECs中的NF-κB

20 μmol/L NC處理HUVECs 24 h后，磷酸化AMPK水平顯著增高(P<0.05)(圖1A)。相比之下，LPS處理后所致的NF-κB p65亞基磷酸化能被NC所抑制(圖1B)。而采用AMPK siRNA處理后，NC對p65磷酸化的抑制效應明顯減弱。

2.2 煙酸姜黃素酯抑制LPS誘導HUVECs黏附分子表達和單核細胞黏附

LPS處理前用20 μmol/L NC預處理細胞后，ICAM-1，VCAM-1和E選擇素表達明顯降低(圖2A)。此外， THP-1細胞與HUVECs的黏附作用也明顯減少(圖2B)。而預先采用AMPK siRNA沉默其表達后，NC的上述效應有所減弱。

2.3 煙酸姜黃素酯下調LPS誘導HUVECs分泌促炎細胞因子

LPS處理HUVECs后，培養(yǎng)上清中TNF-α和MCP-1水平顯著增高，而經(jīng)NC預處理后，其含量明顯減少(P<0.05)。此外，采用siRNA沉默AMPK后，NC的抑制效應有所降低(圖3)。

2.4 煙酸姜黃素酯經(jīng)AMPK減輕LPS誘導的內質網(wǎng)應激

NC處理后可下調LPS所致的內質網(wǎng)應激標志分子IRE-1、eIF2α和CHOP的表達水平。而干擾AMPK表達后，可明顯削弱煙NC對這些分子的抑制效應(P<0.05)(圖4)。

3 討論

在動脈粥樣硬化過程中，促炎細胞因子和黏附分子誘導單核細胞黏附和滲透到內皮是動脈粥樣硬化發(fā)生的關鍵[8]。先前的研究結果表明，NC防性給藥能抑制高脂喂養(yǎng)所致的ApoE-/-小鼠動脈硬化斑塊的形成，并能降低血清中TNF-α和IL-6的水平[9]。在本研究中，采用NC作用于人血管內皮細胞后，對LPS誘導的TNF-α和MCP-1分泌明顯減少，而用siRNA沉默AMPK的表達后，則可明顯消除該效應。表明NC有可能通過激活AMPK而發(fā)揮抑制炎性反應的作用。研究還發(fā)現(xiàn)姜黃素處理能促進AMPK的磷酸化[10]。NF-κB是炎性反應和免疫應答過程中調控各種細胞因子表達的關鍵轉錄因子。此外，黏附分子如ICAM-1、VCAM-1和E-選擇素的表達也受NF-κB的調節(jié)[11]。本研究也證實，NC處理后，LPS誘導的人血管內皮細胞中的NF-κB磷酸化明顯降低。與預期結果一致，LPS誘導單核細胞對內皮細胞的黏附以及VCAM-1、ICAM-1和E-選擇素的表達也有所降低。該效應均可被AMPK siRNA所逆轉。因此，以上結果表明NC延緩動脈粥樣硬化發(fā)生進展可能得益于其對AMPK信號通路的激活。

A.effect of nicotinate-curcumin on AMPK phosphorylation; B.silence of AMPK abrogates nicotinate-curcumin inhibited p65 phosphorylation upon LPS stimulation; *P<0.05 compared with the indicated groups圖1 煙酸姜黃素酯對AMPK和NF-κB磷酸化的影響Fig 1 Nicotinate-curcumin affected phosphorylation of AMPK and

A.effect of nicotinate-curcumin on adhesion molecules expression upon LPS stimulation; *P<0.05 compared with the LPS groups；#P<0.05 compared with the NC+LPS groups； B.nicotinate-curcumin blocked the LPS-induced adhesion of THP-1 cells to HUVECs;*P<0.05 compared with the indicated groups圖2 煙酸姜黃素酯對LPS誘導的黏附相關分子表達及單核細胞黏附的影響Fig 2 Nicotinate-curcumin inhibited the expression of LPS-induced adhesion molecules and adhesion of

The inhibitory effec of nicotinate-curcumin on LPS-induced pro-inflammation TNF-α(A) and MCP-1 (B) secretion; *P<0.05 compared with the LPS groups; #P<0.05 compared with the NC+LPS groups圖3 煙酸姜黃素酯對LPS誘導HUVECs分泌促炎細胞因子的影響Fig 3 Nicotinate-curcumin ameliorated LPS-induced pro-inflammation cytokines secretion in

*P<0.05 compared with the LPS groups；#P<0.05，compared with the NC+LPS groups圖4 沉默AMPK對煙酸姜黃素酯減輕HUVECs內質網(wǎng)標志分子表達的影響Fig 4 Silence of AMPK on nicotinate-curcumin attenuated LPS-induced endoplasmic reticulum stress associated moleculars in

本研究證實了NC能減輕LPS誘導的內皮細胞內質網(wǎng)應激，具體表現(xiàn)為IRE-1、eIF2α和CHOP的表達水平降低;而干擾AMPK表達后，可明顯削弱NC對這些分子的抑制效應，表明NC減輕內質網(wǎng)應激與AMPK的活性有關。用β-氨基異丁酸(BAIBA)處理后，鏈脲佐菌素/高脂飲食誘導的內質網(wǎng)應激小鼠肝組織中eIF2α和JNK磷酸化降低，GRP78和ATF4表達減少，從而改善2型糖尿病小鼠的肝細胞凋亡和肝損傷[12]。然而，采用siRNA沉默AMPK后可消除這些作用。這些結果也輔助證明內質網(wǎng)應激受AMPK途徑調控，NC誘導的AMPK活化可能以一種氧化應激獨立的方式抑制ER應激、細胞凋亡和動脈粥樣硬化進展。

總之，本研究證明NC通過AMPK依賴性信號傳導改善了LPS誘導的NF-κB磷酸化，消除了LPS誘導的黏附分子和內皮中促炎細胞因子的表達。此外，NC通過激活AMPK抑制LPS誘導的血管內皮細胞應激，從而減輕動脈粥樣硬化進展。提示,NC應是一種治療動脈粥樣硬化的潛在藥物。在未來研究中，將采用ApoE或低密度脂蛋白受體缺陷型小鼠進一步明確NC對動脈粥樣硬化病變的大小和斑塊穩(wěn)定性的影響，并用生物素結合實驗進一步明確NC的特定受體來闡其激活AMPK機制。