炎性細胞因子和凋亡相關(guān)蛋白參與大鼠下肢深靜脈血栓形成

馮 濤，李 晶，潘金強，鄭殿宇，陳 輝，杜曼·巴戈達提，耿中利*

(新疆醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院 1.普外二科； 2.內(nèi)分泌科，新疆 烏魯木齊 830000)

深靜脈血栓形成(deep vein thrombosis, DVT)是由于靜脈內(nèi)壁細胞損傷，血液異常凝集和血流速率變慢導致外周血管疾病，發(fā)病率高，占血管疾病總數(shù)的40%左右，同時可以誘導產(chǎn)生一系列嚴重的并發(fā)癥和死亡現(xiàn)象[1]。比如有5%～10%的深靜脈血栓患者會出現(xiàn)致死性肺動脈栓塞、50%左右的患者會發(fā)展成慢性期致殘性的血栓后綜合征[2]。這兩種癥狀都嚴重的威脅著患者的生命健康。

深靜脈血栓病發(fā)部位主要是下肢，在臨床上會出現(xiàn)肢體的外在組織形態(tài)變化、疼痛、膚色變化等表現(xiàn)。其血栓脫落可引發(fā)肺栓塞[3]。炎性因子在下肢DVT形成中起著重要作用[4]，參與了下肢血管壁內(nèi)皮細胞損傷所導致的DVT的形成和發(fā)展。微RNAs(miRNAs)是一類長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA序列分子，參與轉(zhuǎn)錄后基因表達的調(diào)控反應，在維持機體內(nèi)細胞穩(wěn)定分化、增殖、凋亡等方面具有及其重要的作用，目前已發(fā)現(xiàn)少量miRNAs在 DVT 發(fā)病中的作用[5]。本研究預通過檢測不同分組內(nèi)DVT大鼠血清 IL-1β、TNF-α水平和凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2的表達，來驗證miR-5189-3p在下肢深靜脈血栓形成中對相關(guān)炎性細胞因子和凋亡相關(guān)蛋白的表達調(diào)控作用，為后期臨床治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：SPF級7～8周SD大鼠48只，體質(zhì)量180～200 g (新疆醫(yī)科大學動物中心，動物許可證：XJYK-2019-0013)。

1.1.2 實驗試劑：HE染色試劑盒(Solarbio公司)；BCA 蛋白濃度測定試劑盒、Bax Polyclonal Antibody和Bcl-2 Polyclonal Antibody(Bioswamp公司)；大鼠白介素1β ELISA試劑盒和大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA試劑盒 (Cusabio公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物的分組及處理：將大鼠分為對照組(control)；下腔靜脈血栓模型組(model)，暴露下腔靜脈，5-0絲線結(jié)扎下腔靜脈分支至髂靜脈；miR-5189-3p抑制劑組(miR-5189-3p inhibitor)，尾靜脈注入5 μg/kg miR-5189-3p inhibitor；miR-5189-3p抑制劑陰性對照組(miR-5189-3p inhibitor NC)，尾靜脈注入5 μg/kg miR-5189-3p抑制劑，每組10只。

1.2.2 靜脈血栓組織病理學檢查：用4%多聚甲醛磷酸緩沖液固定下腔靜脈血栓組織標本，石蠟包埋、切片，經(jīng)蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining, HE)染色后在光鏡下觀察組織病理變化。

1.2.3 ELISA檢測炎性因子水平：分離血漿，按照ELISA試劑說明書檢測IL-1β、TNF-α水平。

1.2.4 Western blot檢測Bax、Bcl-2蛋白表達：將少量組織塊置于1～2 mL勻漿器中球狀部位，加400 μL單去污劑裂解液(含PMSF)于勻漿器中進行勻漿，重復碾幾次使組織盡量碾碎，裂解30 min后，在4 ℃，12 000 r/min離心5 min，取適當稀釋的上清液用 BCA法來測定蛋白濃度，調(diào)整蛋白質(zhì)濃度后用免疫印跡法(Western blot) 檢測組織內(nèi)Bax、Bcl-2的表達， 其步驟大致如下;經(jīng)過灌膠、加樣、電泳、轉(zhuǎn)膜后，將膜裝入 5% BSA封閉液，制置室溫搖床1 h，加5 mL一抗稀釋液 于 4 ℃冰箱過夜。然后加10 mL二抗稀釋液(1∶10 000) 置于搖床上1 h，顯色，在暗室中壓片曝光顯影， 結(jié)果用 Quantity-one圖像軟件分析并進行吸光度值掃描，分別計算目的蛋白條帶與GAPDH吸光度值比值(%)。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 靜脈血栓組織病理變化

模型組，血栓充滿靜脈管腔，與靜脈管壁未見明顯的黏連，無血管內(nèi)皮細胞脫落，有少量炎性細胞浸潤。miR-5189-3p抑制劑組，血栓未見明顯機化，與靜脈管壁未見明顯的黏連，有大量炎性細胞出現(xiàn)，有少量內(nèi)皮細胞脫落。miR-5189-3p抑制劑陰性對照組，靜脈血栓機化，血栓與靜脈管壁有明顯黏連，肉芽組織出現(xiàn)，有血流再通的征象，可見少許紅細胞的存在(圖1)。

2.2 ELISA檢測大鼠血漿IL-1β、TNF-α含量

模型組IL-1β和TNF-α含量較對照組顯著升高(P<0.05)，miR-5189-3p抑制劑組較模型組進一步升高(P<0.05)；miR-5189-3p抑制劑陰性對照較模型組顯著回降(P<0.05)，但仍高于對照組(表1,圖2)。

2.3 BAX和Bcl-2在下腔靜脈組織內(nèi)的表達情況

模型組Bax蛋白表達較對照組顯著升高(P<0.05)，miR-5189-3p抑制劑組較模型組進一步升高(P<0.05)，miR-5189-3p抑制劑陰性對照較模型組顯著回降(P<0.05)。模型組Bcl-2蛋白表達較對照組顯著降低(P<0.05)，miR-5189-3p抑制劑組較模型組進一步降低(P<0.05)，miR-5189-3p抑制劑陰性對照較模型組顯著回升(P<0.05)(圖3，表2)。

A.control group, there was no thrombus in the control group; B.model group, thrombus filled the venous lumen; C.miR-5189-3p inhibitor group, there was no obvious mechanism of thrombus, no obvious adhesion with the venous wall, a large number of inflammatory cells appeared, and a small number of endothelial cells fell off; D.negative control group with miR-5189-3p inhibitor, venous thrombus was institutionalized, thrombus had obvious adhesion to the venous wall, granulation tissue appeared, and signs of blood flow recanalization were observed, with the presence of a few red blood cells圖1 大鼠下腔深靜脈血栓組織的病理變化Fig 1 Pathological changes of the deep inferior vena cava thrombus tissues of the rats(HE staining)

表1 各組血漿中IL-1β、TNF-α的含量情況Table 1 Content of IL-1 and TNF-α in each group (±s， pg/mL, n=10)

表2 BAX和Bcl-2在靜脈組織內(nèi)的表達情況Table 2 Expression of Bax and Bcl-2 in venous tissues (±s，n=10)

A.control group; B.model group; C.miR-5189-3p inhibitor group; D.negative control group with miR-5189-3p inhibitor; *P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with model group; △P<0.05 compared with miR-5189-3p inhibitor group圖2 各組血漿中IL-1β、TNF-α的含量情況Fig 2 Content of IL-1 and TNF-α in each

圖3 不同分組組織中Bax、Bcl-2蛋白表達Fig 3 BAX and Bcl-2 proteins expression in different groups

3 討論

DVT 是周圍血管常見疾病，且近年來發(fā)病率呈逐年升高的趨勢[6]。已成為第三大危害人類健康的外周血管疾病，隨著現(xiàn)代人生活習慣的改變，老年人逐漸增多，外周血管疾病患病率逐年增加[7]。僅美國新增 DVT 患者約 80 萬人/年，大約有37%的患者死于肺動脈栓塞。

miRNA主要參與在轉(zhuǎn)錄水平上，可以起到抑制靶基因的翻譯，在細胞增殖、細胞遷移、血管生成等過程都有參與，在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用。目前已有報道，miRNA可以在血栓機化再通發(fā)揮著重要作用。miRNA在心血管疾病發(fā)生發(fā)展中的作用機制和生物學功能[8]。例如miRNA-92a，通過對其進行功能實驗闡明，上調(diào)miR-92a的會抑制靜脈血栓的溶解再通，而下調(diào)miR-92a可以促進靜脈血栓的溶解再通過程[9]。miR-221可以通過調(diào)節(jié)PAK 1的表達，起到抑制細胞增殖的作用[10-11]。

IL-1β 和TNF-α是炎性反應早期細胞因子，是機體炎性反應早期的標志物[12]。可以直接作用于血管內(nèi)皮細胞，對內(nèi)皮細胞進行破壞，造成功能異常，促局部血栓形成。 因此IL-1β和TNF-α在血栓的形成中發(fā)揮重要作用。本次實驗結(jié)果表明，IL-1β 和TNF-α在不同分組內(nèi)表達量差異明顯，miR-5189-3p對炎性反應因子IL-1β 和TNF-α起到明顯的調(diào)節(jié)作用，抑制miR-5189-3p，可以增加炎性反應因子的表達量，提示miR-5189-3p參與了血栓形成的過程。

BAX和Bcl-2是一類細胞凋亡相關(guān)性蛋白。BAX是促進細胞凋亡蛋白，而Bcl-2是抑制細胞凋亡蛋白。通過Bcl-2和BAX的蛋白表達比值可以判斷，抑制miR-5189-3p，會明顯的促進細胞凋亡；而miR-5189-3p可以有效的抑制細胞凋亡。本次實驗結(jié)果說明，miR-5189-3p在內(nèi)皮細胞凋亡過程中，起到抑制作用。病理結(jié)果也通過C組和D組的比對說明了，抑制miR-5189-3p會導致血栓機化過程降低，血栓溶解再通周期變長，提示miR-5189-3p參與了血栓形成的過程。

總之，miR-5189-3p尚屬于研究較少的miRNA，也是一種較新的miRNA。通過HE染色、Western blot和ELISA實驗，說明抑制miR-5189-3p可以降低血栓的機化和溶解再通，促進細胞凋亡，從而導致血栓的形成加劇。進一步說明了miR-5189-3p通過調(diào)節(jié)炎性細胞因子和凋亡相關(guān)蛋白可以起到抑制靜脈血栓形成的作用。