伴CSF1R-Y571D突變的急性髓系白血病細(xì)胞系GDM-1的增殖機(jī)制

曹 瓊，徐凝馨，李小文，吳 昊，郝建卿，覃艷紅，李 莉*

(1.山西醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030001； 2.山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 血液科, 山西 太原 030001)

急性髓性白血病 (acute myeloid leukemia, AML)是由于髓系造血干/祖細(xì)胞發(fā)生累積性獲得性基因改變, 導(dǎo)致細(xì)胞增殖、分化和凋亡途徑發(fā)生改變的一種惡性疾病[1]。基因突變是誘發(fā)AML的重要機(jī)制之一，現(xiàn)已證實(shí)導(dǎo)致AML發(fā)生的突變主要有AML1/ETO[2]、PML-RARa[3]、MLL基因重排[4-5]等。伴隨這些突變使處于正常分化的骨髓造血祖細(xì)胞分化發(fā)生停滯，細(xì)胞持續(xù)惡性增殖。近年來(lái)，針對(duì)特定基因突變而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的小分子抑制劑也逐漸用于臨床，如imatinib[6]、gefitinib[7]等。

集落刺激因子-1受體(colony stimulating factor-1receptor,CSF1R)是一種Ⅲ型受體酪氨酸激酶，在巨噬細(xì)胞中表達(dá)，激活CSF1R的配體有兩個(gè)：M-CSF(CSF-1)和IL-34[8]。作為受體酪氨酸激酶家族(receptor tyrosine kinases,RTK)，CSF1R磷酸化位點(diǎn)可作為多種激酶的?？课稽c(diǎn)，其中包括Src家族激酶(Src family kinase，SFK)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的p85亞基等[9]。CSF1R異常表達(dá)在多種腫瘤細(xì)胞的分化和增殖中起著關(guān)鍵作用[10]，如乳腺癌[11]、胃癌[12]和肺癌[13]。急性髓系白血病細(xì)胞系GDM-1伴有CSF1R基因突變，本研究主要通過(guò)蛋白激酶抑制方法來(lái)研究急性髓系白血病細(xì)胞系GDM-1的增殖機(jī)制，并探討促進(jìn)GDM-1增殖的主要信號(hào)通路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系：人急性髓性白血病細(xì)胞系GDM-1、人單核巨噬細(xì)胞系THP-1(ATCC公司)；細(xì)胞培養(yǎng)所用培養(yǎng)基含有10%的胎牛血清的RPMI Medium 1640，細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中。

1.1.2 主要試劑：蛋白激酶抑制劑(protein kinase inhibitors，PKIs)見(jiàn)表1(Selleckchem公司)；將抑制劑粉末溶于DMSO，配置濃度為20 mmol/L的儲(chǔ)備液-80 ℃保存。細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI Medium 1640(Hyclone公司)；胎牛血清(賽澳美細(xì)胞技術(shù)有限公司)；細(xì)胞因子M-CSF(Bio-techne公司)；CCK8、抗兔二抗(博士德生物工程有限公司)；DMSO(北京索萊寶科技有限公司)；GAPDH(Proteintech公司)；p-Src、ERK、p-ERK(Cell Signaling Technology公司)；Src(上海生工生物工程有限公司)。

表1 蛋白激酶抑制劑Table 1 Proteinkinase inhibitors

1.2 方法

1.2.1 蛋白激酶抑制實(shí)驗(yàn)：以8 000個(gè)/孔的細(xì)胞數(shù)接種GDM-1細(xì)胞于96孔板，設(shè)置藥物實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組、空白組，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，其中藥物實(shí)驗(yàn)組設(shè)置8個(gè)藥物濃度，最高藥物濃度為20 μmol/L(藥物濃度梯度為20、5、1.25、0.312 5、0.078 125、0.019 531、0.004 883、0.001 22 μmol/L)。72 h之后CCK8法計(jì)算細(xì)胞在不同藥物濃度作用下GDM-1的抑制率。

1.2.2 細(xì)胞因子促增殖實(shí)驗(yàn)：于96孔板以5 000個(gè)/孔的細(xì)胞數(shù)接種GDM-1、THP-1細(xì)胞，設(shè)置M-CSF細(xì)胞因子實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，其中細(xì)胞因子實(shí)驗(yàn)組為2% FBS-RPMI-1640培養(yǎng)基下加入細(xì)胞因子濃度為20 ng/mL，以及相對(duì)應(yīng)的對(duì)照組。72 h之后CCK8法分析在生長(zhǎng)因子作用下GDM-1的增殖情況。

1.2.3 蛋白激酶抑制劑聯(lián)合細(xì)胞因子實(shí)驗(yàn)： 以5 000個(gè)/孔的細(xì)胞數(shù)接種GDM-1細(xì)胞于96孔板中，設(shè)置對(duì)照組，10% FBS-RPMI1640；細(xì)胞因子組：10% FBS-RPMI1640+CSF；藥物組：10% FBS-RPMI1640+PKIs；細(xì)胞因子聯(lián)合藥物實(shí)驗(yàn)組：10% FBS-RPMI 1640+CSF+PKIs，其中CSF1終濃度為20 ng/mL；bosutinib終濃度為0.1 μmol/L，HG6-64-1終濃度為2.5 μmol/L。72 h后CCK法檢測(cè)4組細(xì)胞的增殖情況。

1.2.4 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)：將GDM-1在不同的蛋白激酶抑制劑作用1 h，藥物組有l(wèi)inifanib(0.1 μmol/L)、bosutinib(0.1 μmol/L)，sorafenib(0.1 μmol/L)對(duì)照組僅添加DMSO處理相同時(shí)間。2 h后提取細(xì)胞蛋白質(zhì)，測(cè)定蛋白質(zhì)濃度后 SDS-PAGE電泳分離，半干轉(zhuǎn)法將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至PVDF膜，0.5% BSA室溫振蕩封閉2 h；一抗4 ℃孵育過(guò)夜；相對(duì)應(yīng)二抗室溫振蕩孵育1.5 h后采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 酪氨酸激酶抑制實(shí)驗(yàn)分析GDM-1細(xì)胞增殖機(jī)制

選擇10種蛋白激酶抑制劑作用于GDM-1細(xì)胞，將藥物對(duì)細(xì)胞的作用分為兩類：敏感以及不敏感。計(jì)算這10種藥物作用于細(xì)胞的半抑制濃度IC50(表2)，分析結(jié)果將IC50低于1 μmol/L能夠抑制細(xì)胞增殖的蛋白激酶抑制劑定為敏感，能夠抑制細(xì)胞增殖的藥物主要有l(wèi)inifanib(CSF1R)，bosutinib(SFK)，WH-4-023(Lck/Src)、dasatinib(SFK)以及sorafenib(B-raf，ERK)(圖1)。

表2 10種PKIs作用靶點(diǎn)及抑制GDM-1細(xì)胞的IC50值Table 2 Targets and IC50 values for GDM-1 cells of 10 PKIs

A.five kinds of PKIs sensitive to GDM-1 cells after incubation 72 hours; B.five kinds of PKIs insensitive to GDM-1 cells after incubation 72 hours圖1 10種PKIs對(duì)GDM-1細(xì)胞增殖的抑制作用Fig 1 Inhibition effect of 10 kinds of PKIs on the proliferation of GDM-1 n=3)

2.2 M-CSF細(xì)胞因子促GDM-1細(xì)胞增殖

在低濃度胎牛血清(2% FBS)RPMI-1640培養(yǎng)基中加入M-CSF 20 ng/mL作用72 h，CSF1R突變型GDM-1細(xì)胞增殖明顯增加(圖2)，增長(zhǎng)率為對(duì)照組的11.3倍；而CSF1R野生型THP-1細(xì)胞在細(xì)胞因子作用下增殖效果與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

*P<0.001 compared with 2% FBS圖2 M-CSF對(duì)GDM-1及THP-1細(xì)胞增殖的影響Fig 2 Effects of M-CSF on proliferation of GDM-1

2.3 Western blot 檢測(cè)信號(hào)通路中蛋白激酶磷酸化水平

Western bolt分析激酶抑制劑linifanib、bosutinib、dasatinib、sorafenib作用下細(xì)胞下游信號(hào)通路中蛋白激酶磷酸化水平的改變(圖3A)，結(jié)果表明：linifanib作用下Src磷酸化水平顯著下降(P<0.01)(圖3B)，同時(shí)ERK的磷酸化水平也下降(圖3C)；bosutinib也能夠抑制ERK的磷酸化水平(P<0.01)；當(dāng)應(yīng)用ERK抑制劑sorafenib作用于GDM-1細(xì)胞，結(jié)果顯示：Src磷酸水平未見(jiàn)明顯改變，ERK磷酸化水平明顯下降(P<0.01)。

2.4 蛋白激酶抑制劑聯(lián)合M-CSF細(xì)胞因子對(duì)GDM-1細(xì)胞增殖的影響

酪氨酸激酶抑制實(shí)驗(yàn)得到SFK抑制劑bosutinib，braf的抑制劑sorafenib對(duì)GDM-1敏感，sorafenib的作用靶點(diǎn)眾多，而HG6-64-1是braf高選擇性的激酶抑制劑。單獨(dú)應(yīng)用bosutinib或聯(lián)合應(yīng)用bosutinib與M-CSF，GDM-1細(xì)胞增殖與對(duì)照組相比都處于完全抑制狀態(tài)(圖4A)；而單獨(dú)使用HG6-64-1，GDM-1細(xì)胞增殖與對(duì)照組相比受到抑制，聯(lián)合HG6-64-1與M-CSF時(shí)GDM-1細(xì)胞增殖能夠恢復(fù)(圖4B)。

3 討論

本研究通過(guò)PKIs研究急性髓系白血病細(xì)胞系GDM-1的增殖機(jī)制，蛋白激酶抑制實(shí)驗(yàn)篩選出能夠抑制GDM-1細(xì)胞增殖的靶向藥物有l(wèi)inifanib，bosutinib，WH-4-023、dasatinib以及sorafenib。dasatinib、bosutinib抑制效果最佳，是SFK選擇性較高的激酶抑制劑[14]，說(shuō)明Src信號(hào)通路在GDM-1的增殖中有重要作用。通過(guò)查詢COSMIC數(shù)據(jù)庫(kù)[15](https://cancer.sanger.ac.uk/cell_lines/sample/overview?id=906870)， GDM-1細(xì)胞Src激酶家族中各成員均未存在突變[16]。

A.Western blot from whole GDM-1 cell lysates treated with linifanib,bosutinib, sorafenib for 24 hours; B.normalized to GAPDH loading control and to the level of Src, the expression levels of phosphorylation Src, *P<0.01 compared with control group; C.normalized to GAPDH loading control and to the level of ERK1/2, the expression levels of phosphorylation ERK, *P<0.01 compared with control group圖3 激酶抑制劑作用于GDM-1細(xì)胞時(shí)內(nèi)激酶磷酸化水平的變化Fig 3 Phosphorylation levels of key protein kinases in GDM-1 cells treated with kinase n=3)

A.bosutinib inhibited cell proliferation compared with control and simulating by M-CSF, *P<0.001 compared with control group; B.HG6-64-1 inhibited cell proliferation compared with control, it did not inhibit cell proliferation when combined with simulating by M-CSF, *P<0.001 compared with control group圖4 PKIs及細(xì)胞因子M-CSF聯(lián)合作用于GDM-1細(xì)胞Fig 4 GDM-1 cell proliferation treated with bosutinib,HG6-64-1 and n=3)

Chase等[17]的研究中發(fā)現(xiàn)GDM-1細(xì)胞在激酶抑制劑imatinib作用下能夠通過(guò)抑制CSF1R的磷酸化水平來(lái)抑制細(xì)胞增殖。Makishima等[18]的研究結(jié)果證明dasatinib能夠抑制GDM-1細(xì)胞的增殖，原因在于其能夠抑制眾多激酶包括SFK和CSF1R的活性，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相一致。在CSF1R的激酶抑制劑linifanib[19-20]作用下Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明在GDM-1細(xì)胞中CSF1R通過(guò)調(diào)控Src及MAPK信號(hào)通路的活性來(lái)促進(jìn)細(xì)胞增殖。

GDM-1細(xì)胞能夠在M-CSF激活CSF1R作用下刺激細(xì)胞增殖，也證明CSF1R在GDM-1細(xì)胞增殖中的重要作用。Chase等[17]的研究中對(duì)細(xì)胞系GDM-1 CSF1R進(jìn)行測(cè)序得到在第12外顯子中存在2003T>G錯(cuò)義突變，該突變會(huì)導(dǎo)致的氨基酸變化為Y571D。伴隨該突變使得CSF1R處于一個(gè)持續(xù)高活性狀態(tài)，尤其是在細(xì)胞因子M-CSF刺激下。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示在GDM-1細(xì)胞中加入細(xì)胞因子M-CSF，細(xì)胞增殖明顯升高，因此，伴CSF1R-Y571D突變使CSF1R增高對(duì)細(xì)胞因子M-CSF敏感性且受體處于持續(xù)高活性狀態(tài)。

在蛋白激酶抑制實(shí)驗(yàn)中也觀察到sorafenib同樣可以抑制GDM-1細(xì)胞的增殖，說(shuō)明MAPK信號(hào)通路在GDM-1細(xì)胞的增殖中也發(fā)揮重要作用。由于sorafenib能夠抑制的激酶靶點(diǎn)眾多[21]，HG6-64-1作為Braf的高選擇性抑制劑來(lái)驗(yàn)證GDM-1細(xì)胞中MAPK信號(hào)通路的重要性。本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)bosutinib聯(lián)合細(xì)胞因子M-CSF, GDM-1細(xì)胞的增殖被抑制，而HG6-64-1聯(lián)合M-CSF對(duì)細(xì)胞增殖作用不能被抑制，說(shuō)明當(dāng)Src信號(hào)通路被抑制后CSF1R不能夠通過(guò)激活MAPK信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)細(xì)胞的增殖；而當(dāng)MAPK信號(hào)通路被抑制，CSF1R仍可通過(guò)激活Src信號(hào)通路的活性來(lái)促進(jìn)細(xì)胞增殖。因此，Src信號(hào)通路是GDM-1細(xì)胞增殖的關(guān)鍵通路，而MAPK信號(hào)通路是GDM-1細(xì)胞增殖可替代的通路。

綜上，GDM-1細(xì)胞存在CSF1R-Y571D突變，該突變使得CSF1R自身活性提高，并招募下游信號(hào)分子，尤其是Src家族激酶，通過(guò)激活Src信號(hào)通路及MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖。本文通過(guò)尋找在白血病細(xì)胞增殖中能夠引起下游信號(hào)通路活性增高的突變，為急性髓系白血病的增殖機(jī)制研究提供研究思路，也為急性髓系白血病的治療提供新的靶標(biāo)。