代謝型谷氨酸受體5(mGluR5)調控白色脂肪細胞棕色化

羅 燮，曾 粒，袁 磊*

(重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 1.內分泌科； 2.腎內科， 重慶 400010)

肥胖(obesity)是一個重要的公共健康問題，嚴重影響生活質量和壽命[1]。藥物治療對于控制肥胖十分重要，但目前上市的減肥藥物主要通過中樞神經系統(tǒng)抑制食欲，或者通過胃腸道系統(tǒng)，抑制能量吸收達到治療肥胖的效果[2]。目前尚沒有直接作用于脂肪細胞來調控體質量從而治療肥胖的藥物。白色脂肪細胞是經典脂肪細胞，可儲存體內過多的能量，引起肥胖。棕色脂肪細胞因含有大量線粒體，以產熱的形式消耗能量，可對抗肥胖。研究表明白色脂肪細胞在特定條件下可向棕色脂肪細胞轉化，產熱耗能，增加代謝活性，這一轉化的過程稱為白色脂肪細胞棕色化/米色化[3-5]。即使是極少量的棕色/米色脂肪細胞，也可獲得極大的質量及代謝收益[6]。代謝型谷氨酸受體(mGluRs) 主要表達在中樞神經系統(tǒng)，與焦慮、抑郁、疼痛、帕金森等多種神經精神疾病相關，其在外周也有一定的表達和作用[7]。既往研究發(fā)現mGluR5拮抗劑可在不改變小鼠食欲情況下，使小鼠體質量下降，脂肪減少[8]。本研究證明mGluR5拮抗劑可調節(jié)脂肪細胞形態(tài)，促進白色脂肪細胞表達棕色脂肪特異性基因，增強呼吸氧耗率和脂肪分解能力，促進白色脂肪細胞的代謝改變，為治療肥胖提供新的藥物靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與動物：小鼠白色脂肪前體細胞系(3T3L1細胞，ATCC公司); SPF級6～8周雄性C57BL/6小鼠5只，體質量20～23 g [重慶醫(yī)科大學實驗動物中心，合格證號: scxk(渝)2012-0001]。

1.1.2 主要試劑：DMEM高糖培養(yǎng)基、小牛血清BS(Gibco公司)；胎牛血清FBS、地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、牛胰島素、磷酸鹽緩沖液、二甲基亞砜(DMSO)、氯化鈉、乙醇、BODIPY 493/503、Triton分析純試劑、DL-二硫蘇糖醇、硫酸鎂分析純試劑和Trizol試劑盒(Invitrogen公司)；ECL發(fā)光液(Bio-Rad公司)；RT-PCR試劑盒(Applied Biosystems公司)；iTaq Universal SYBR Green Super Master Mix(Bio-Rad公司)；兔抗mGluR5一抗、驢抗兔抗體二抗(Abcam公司)；MPEP hydrochloride、SIB 1893、游離甘油試劑盒(Sigma-Aldrich公司);XF24 extracellular flux assay kits(Seahorse Bioscience公司)。

1.2 方法

1.2.1 3T3L1細胞的培養(yǎng)、分化及處理：將白色脂肪前體細胞3T3L1誘導分化至第9天，用mGluR5拮抗劑MPEP、SIB處理細胞，DMSO作為對照，每2 d處理1次，共處理細胞4次，8 d后收集細胞。

1.2.2 Western blot檢測小鼠脂肪組織mGluR5蛋白的表達: 提取小鼠 (n=5) 腹股溝白色脂肪組織(subcutaneous white adipose tissues, SubWAT)，附睪脂肪組織(epididymal white adipose tissues, EpiWAT)，棕色脂肪組織(brown adipose tissue, BAT)，胰腺組織(pancreas, 陰性對照)，嗅泡組織 (olfactory bulb，陽性對照)，使用裂解液裂解并提取組織蛋白，測定蛋白濃度，然后進行上樣、電泳、轉膜，用牛奶封閉后一抗孵育過夜，TBST洗3次后進行二抗孵育 2 h，TBST洗膜后ECL顯色，并置于Bio-rad成像儀中曝光，后定量分析條帶。

1.2.3 脂滴BODIPY染色：3T3L1細胞分化處理后，棄細胞液，PBS洗滌，甲醛固定細胞，加入BODIPY 493/503溶液，脂滴染色20 min，棄染色液后PBS洗滌，DAPI染色。熒光顯微鏡下觀察脂肪細胞脂滴變化，脂滴被BODIPY 493/503染色，發(fā)出綠色熒光，細胞核被DAPI染色，發(fā)出藍色熒光。

1.2.4 RT-qPCR檢測mRNA表達：使用Trizol法提取處理后3T3L1細胞mRNA, 檢測RNA濃度，并進行反轉錄。再以mTBP作為內參，以cDNA為模板，通過SYBR Green檢測各基因的相對表達。各特異性引物的基因分別為:mTBP(上游：5′-GAAGCT GCGGTACAATTCCAG-3′,下游：5′-CCCCTTGTACC CTTCACCAAT-3′);CP1(上游：5′-ACTGCCACACCT CCAGTCATT-3′,下游：5′-CTTTGCCTCACTCAGGA TTGG-3′);AP2(上游：5′-ACACCGAGATTTCCTTC AAACTG-3′,下游：5′-CCATCTAGGGTTATGATGCT CTTC-3′);PRDM16(上游：5′-TCTTACTTCTCCGA GATCCGAAA-3′,下游：5′-GATCTCAGGCCGTTTGTC CAT-3′);Nrf1(上游：5′-AGCACGGAGTGACCCAA AC-3′,下游：5′-TGTACGTGGCTACATGGACCT-3′);Tfam(上游：5′-ATTCCGAAGTGTTTTTCCAGCA3′,下游：5′-TCTGAAAGTTTTGCATCTGGGT-3′);Tfb2m(上游：5′-GGCCCATCTTGCATTCTAGGG-3′,下游：5′-CAGGCAACGGCTCTATATTGAAG-3′);Polg(上游：5′-GGCTGACCTAACCCCTTTGG-3′,下游：5′-CTGTT CCCTGATATGGGCTCG-3′);Cox3(上游：5′-TCCAAGTCCATGACCATTAACTG-3′,下游：5′-TAT TTGGTGAGTAGGCCAAGGG-3′);mtND1(上游：5′-GAGCATCTTATCCACGCTTCC-3′,下游：5′-GTACTC CCGCTGTAAAAATTGGT-3′);Cpt1(上游：5′-CTCC GCCTGAGCCATGAAG-3′,下游：5′-CACCAGTGAT GATGCCATTCT-3′)。

1.2.5 細胞耗氧率(oxygen consumption rate, OCR)的測定: 用Seahorse檢測OCR，可反應細胞呼吸情況。收集細胞，調整細胞濃度至1.8×104個/mL，加入至XF24 細胞培養(yǎng)板中，每孔加入100 μL細胞懸液;用于調整背景信號的孔(A1, B4, C3, D6)中加入培養(yǎng)液(不含細胞)。培養(yǎng)細胞并誘導分化后MPEP, SIB及 DMSO處理細胞。測試前移除細胞培養(yǎng)液，加入XF分析培養(yǎng)基，37 ℃無CO2培養(yǎng)箱孵育1 h。將寡霉素(oligomycin, oligo)，線粒體解偶聯劑：羰基-氰-對-三氟甲氧基本腙(carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone，FCCP), 抗霉素A和魚藤酮 (antimycin A & rotenone)和XF分析培養(yǎng)基分別加入藥物注射槽中，校正儀器后，置入準備好的細胞，按程序設定加入oligo、FCCP和antimycin A & rotenone進行測量，空白對照中加入XF分析培養(yǎng)基。記錄每個孔15個點的OCR值。完成測定后立即用甲醛固定細胞，用DAPI染色。用 image J軟件分析細胞總數。每孔的OCR測量值用細胞總數標準化。Oligo是ATP合酶抑制劑，加入oligo之前的OCR值為基礎呼吸，包括線粒體氧化磷酸化及質子漏耗氧。加入oligo后OCR值代表質子漏耗氧，減少的OCR代表機體用于ATP合成的呼吸，FCCP是一種解偶聯劑，使質子大量漏過線粒體膜，加入FCCP后OCR值代表細胞最大呼吸耗氧能力。而抗霉素A和魚藤酮(antimycin，rotenone)是呼吸鏈抑制劑，可完全抑制線粒體耗氧。

1.2.6 游離甘油釋放試驗(free glycerol release assay)：MPEP及SIB處理后的細胞加入PBS洗滌，移除PBS，加入等量含或不含毛喉素 (forskolin，FSK) 的Hank平衡鹽溶液(HBSS)，饑餓處理，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2 h，收集HBSS。用游離甘油試劑盒檢測甘油含量。根據操作步驟做標準曲線，將 100 μL游離甘油試劑加入至2.5 μL收集的HBSS及標準液中，搖晃30 s，37 ℃孵育5 min，讀取A540吸光度值。收集細胞加入細胞裂解液，檢測蛋白濃度。每孔用蛋白濃度標準化甘油釋放量。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 mGluR5 在脂肪組織中表達

小鼠BAT、SubWAT、EpiWAT均表達mGluR5，olfactory bulb(陽性對照)大量表達mGluR5，pancreas極少量表達mGluR5 (陰性對照)。mGluR5在白色脂肪組織的表達特別是附睪脂肪組織比在棕色脂肪組織的表達顯著增加 (圖 1)。

*P<0.05 compared with BAT group圖1 mGluR5在不同組織的表達Fig 1 mGluR5 expressed in different n=5)

2.2 mGluR5調節(jié)脂肪細胞脂滴形態(tài)

mGluR5拮抗劑(MPEP，SIB)可調節(jié)分化成熟的3T3L1細胞形態(tài)。與對照組相比，mGluR5拮抗劑(MPEP，SIB)處理后脂肪細胞脂滴體積減小，數量增加(圖2)。

2.3 mGluR5調節(jié)棕色脂肪細胞特異性基因的表達

mGluR5拮抗劑(MPEP，SIB)可在3T3L1細胞中顯著促進棕色脂肪細胞重要調控基因UCP1，PRDM16，PGC1α的表達(P<0.05)，而對脂肪細胞發(fā)育的代表性基因AP2沒有明顯影響(圖3)。

2.4 mGluR5調節(jié)線粒體相關基因的表達

線粒體生成合成核呼吸因子(NRF1)，線粒體編碼轉錄因子A(TFAM)，線粒體編碼轉錄因子B2(TFB2M)，線粒體DNA聚合酶(POLG), 細胞色素c氧化酶亞基Ⅲ(COX3), 還原型NADH泛醌氧化還原型亞基1(MTND1), 和肉堿棕櫚酰轉酶-Ⅰ(CPT1)是線粒體合成與作用的相關蛋白。mGluR5拮抗劑(MPEP，SIB)對脂肪細胞線粒體相關蛋白的基因表達、白色脂肪細胞棕色化有促進的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(圖4)。

2.5 mGluR5調節(jié)細胞呼吸

相比于DMSO處理的細胞，mGluR5拮抗劑 (MPEP，SIB) 可提高3T3L1細胞氧耗率(圖5)。MPEP，SIB處理后可提高脂肪細胞基礎氧耗量。加入oligo后OCR值代表質子漏耗氧，MPEP，SIB 可促進脂肪細胞解偶聯氧耗量。加入FCCP后OCR值為細胞最大呼吸。因此，mGluR5 拮抗劑 (MPEP，SIB)可促進白色脂肪細胞線粒體呼吸功能，增加基礎氧耗量，解偶聯氧耗量與最大呼吸氧耗能力。

圖2 mGluR5拮抗劑(MPEP，SIB)調節(jié)脂肪細胞脂滴形態(tài)Fig 2 mGluR5 antagonists (MPEP, SIB) regulated lipid droplets morphology of adipocytes(×100)

*P<0.05 compared with DMSO group圖3 mGluR5拮抗劑(MPEP，SIB)調節(jié)棕色脂肪細胞特異性基因的表達Fig 3 mGluR5 antagonists (MPEP, SIB) regulated the expression of brown adipocytes specifical genes

圖 4 mGluR5拮抗劑(MPEP，SIB)調節(jié)線粒體相關基因的表達Fig 4 mGluR5 antagonists (MPEP, SIB) regulated

2.6 mGluR5調節(jié)脂肪分解能力(lipolysis)

mGluR5拮抗劑 (MPEP, SIB)可顯著增加脂肪細胞的基礎脂解率(P<0.05)，而用毛喉素(fors-kolin，FSK)刺激細胞后各組脂肪分解能力較刺激前均明顯增加，但與DMSO對照組相比沒有明顯改變(圖6)。因此 mGluR5拮抗劑(MPEP, SIB)可促進白色脂肪細胞的基礎脂肪分解能力，但差異無統(tǒng)計學意義。

圖5 mGluR5拮抗劑(MPEP，SIB)調節(jié)線粒體呼吸Fig 5 mGluR5 antagonists (MPEP, SIB) regulated

*P<0.05 compared with DMSO group圖6 mGluR5拮抗劑(MPEP，SIB)調節(jié)脂肪分解能力Fig 6 mGluR5 antagonists (MPEP, SIB) regulated

3 討論

代謝型谷氨酸受體5(mGluR5)可調節(jié)興奮性谷氨酸遞質和突觸后信號，可作為多種神經系統(tǒng)疾病的藥物作用靶點， 在神經生物領域受到極大關注[7]。既往文獻報道m(xù)GluR5 拮抗劑可作用于中樞神經系統(tǒng)調節(jié)食欲，從而調節(jié)小鼠體質量[8]。有趣的是文獻中同時也指出當人為控制小鼠進食，予以相同飲食時，mGluR5-/-小鼠的體質量仍明顯輕于對照組，顯示mGluR5可能通過中樞食欲調節(jié)以外的其他信號通路調控體質量。同時文獻中指出使用mGluR5拮抗劑處理小鼠時，高脂飲食誘導的肥胖小鼠體質量減輕，脂肪減少，同時能量消耗增加[8]。顯示 mGluR5可能在外周通過脂肪組織調控體質量。既往研究已證實mGluR5在外周也發(fā)揮一定作用[9]，但其是否在脂肪組織中表達及發(fā)揮作用尚不清楚。mGluR5 在中樞神經系統(tǒng)的作用非常廣泛，微小劑量即有可能破壞神經系統(tǒng)平衡，引起抑郁等其他相關副作用[10]。因此，mGluR5通過在外周作用于脂肪組織調控體質量可避免藥物對中樞神經系統(tǒng)的影響。

本研究證實了mGluR5 在不同類型脂肪組織中差異性表達。棕色脂肪細胞mGluR5 的表達明顯低于腹股溝白色脂肪(皮下脂肪組織)及附睪白色脂肪(內臟脂肪組織)，尤其顯著低于附睪白色脂肪。內臟脂肪組織對于代謝異常更有意義[11]。棕色脂肪組織的低表達提示抑制mGluR5可能有助于脂肪細胞特別是內臟脂肪向棕色化轉變。mGluR5拮抗劑處理后，脂肪細胞脂滴體積減小，數量增多，更接近棕色脂肪細胞形態(tài)[3]。mGluR5拮抗劑可在白色脂肪細胞中促進UCP1、PRDM16和PGC1α的表達。UCP1是解偶聯蛋白，是棕色脂肪發(fā)揮產熱耗能作用的特異性蛋白；PRDM16和 PGC1α是棕色脂肪細胞發(fā)育與功能的重要轉錄調控因子。mGluR5 拮抗劑可促進3T3L1 細胞 UCP1 等棕色脂肪細胞特異性基因的表達，并調節(jié)線粒體相關基因表達，從基因水平上證明mGluR5拮抗劑可促進白色脂肪細胞棕色化。棕色脂肪細胞比白色脂肪更加活躍，擁有大量線粒體，有更強的細胞呼吸能力及脂肪分解能力[3]。mGluR5 拮抗劑可促進細胞呼吸及脂肪分解能力，在功能層面上證明mGluR5調控白色脂肪細胞的代謝改變，促進白色脂肪細胞棕色化。mGluR5可能作為藥物作用靶點，成為減肥藥物應用于臨床。