高氧干擾海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞的生長發(fā)育

趙鈺瑋，劉光輝，劉永清，王丹丹，張 健

星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多的神經(jīng)細(xì)胞，保證正常的血腦屏障，為神經(jīng)元提供足夠的

2020-07-14接收

基金項目：安徽省自然基金青年項目(編號：1508085SQH219)

作者單位：1安徽省兒童醫(yī)院新生兒科，合肥 2300512安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院高新分院新生兒科 合肥 230022

作者簡介：趙鈺瑋，女，博士，副主任醫(yī)師，責(zé)任作者：zyw3257@sina.com

營養(yǎng)支持，維持腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)和細(xì)胞外離子環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后可能影響神經(jīng)元的生長發(fā)育[1]。氧療是新生兒急救的重要治療手段，但高濃度氧可能引起腦損傷，加重中樞神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥[2]。 該文通過對日齡6 d新生鼠暴露80%高濃度氧24 h，建立大鼠高氧模型，探討高氧對未成熟腦內(nèi)海馬不同區(qū)域中星形膠質(zhì)細(xì)胞生長發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 模型制備與實驗分組將新生6 d清潔級健康大鼠隨機(jī)分為高氧組和對照組，每組5～6只。高氧組與哺乳母鼠共置于高氧箱中24 h，采用數(shù)字測氧儀(ProOX110，美國BioSpheri公司)持續(xù)檢測箱內(nèi)氧氣濃度，維持箱內(nèi)氧氣濃度始終80%，對照組與哺乳母鼠置于同室空氣中飼養(yǎng)。分別在新生鼠日齡7、14、21 d取材。

1.2 標(biāo)本的采集和處理將日齡7、14、21 d 新生鼠用10%水合氯醛2.0 ml/只麻醉后，固定于自制的手術(shù)木板上，開胸暴露并游離出心臟，經(jīng)左心室插入灌流針并固定，剪開大鼠右心耳，在大鼠左心室緩慢灌注4 ℃磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，直到肝和肺臟顏色轉(zhuǎn)白及右心房流出液澄清，再灌注4 ℃ 4%多聚甲醛15 ml，直至大鼠僵直狀態(tài)，斷頭取腦，將新鮮腦組織置于4%多聚甲醛浸泡固定24 h后行冰凍切片后行免疫熒光實驗。

1.3 免疫熒光技術(shù)及圖像采集取新鮮腦組織于4%PFA固定1 d后行冰凍切片，PBS離心洗滌2次，10%正常血清封閉10 min，然后滴加GFAP抗體(1 ∶200，Abcam,英國)，4 ℃孵育2 h。洗滌后，滴加熒光素標(biāo)記抗體，37 ℃保溫30 min。將和增殖抗體和凋亡抗體免疫熒光共染色的切片，再次PBS離心洗滌，10%正常血清封閉10 min后滴加ki67抗體(1 ∶100，Affinity bioscience)或capase 3抗體(1 ∶100，Affinity bioscience)，4 ℃孵育2 h。洗滌后，滴加熒光素標(biāo)記抗體，37 ℃保溫30 min。

所有切片洗滌后，封片，免疫熒光顯微鏡(Eclipse 80i，日本尼康公司)下觀察海馬CA1、齒狀回(dendategyrus, DG)和hilus區(qū)域，選取200倍鏡像拍照后采用捷達(dá)801D形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)軟件進(jìn)行熒光強(qiáng)度測定。

2 結(jié)果

2.1 高氧后新生大鼠海馬內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞的生長情況在海馬CA1和DG區(qū)域高濃度氧刺激后星形膠質(zhì)細(xì)胞在日齡7、14和21 d時均無明顯變換。但海馬hilus區(qū)域?qū)φ战M新生大鼠海馬內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度隨日齡增加而逐漸增加，高濃度氧刺激后星形膠質(zhì)細(xì)胞在日齡7和14 d時無明顯變化，日齡21 d時星形膠質(zhì)細(xì)胞熒光強(qiáng)度較對照組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.041)(圖1)。

2.2 高氧后新生大鼠海馬內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖情況高氧組海馬DG、hilus和CA1區(qū)域增殖細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度比值在日齡7 d時較對照組均降低，hilus和CA1區(qū)域其熒光比值與對照組比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.036、P=0.040)。高濃度氧刺激后海馬DG、hilus和CA1區(qū)域其比值在日齡14、21 d時與對照組比較無明顯統(tǒng)計學(xué)變化(圖2)。

2.3 高氧后新生大鼠海馬內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡情況高氧組海馬DG、hilus和CA1區(qū)域凋亡細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度比值在日齡7 d時均較對照組降低，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。高氧組海馬DG、hilus和CA1區(qū)域其比值在14 d和21 d時的變化與對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(圖3)。

圖1 不同日齡新生大鼠海馬DG、Hilus和CA1區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞的變化

3 討論

該研究通過建立高氧大鼠動物模型，顯示24 h 80%高氧引起未成熟腦早期海馬hilus和CA1區(qū)域星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖障礙，同時還引起未成熟腦早期海馬hilus區(qū)域星形膠質(zhì)細(xì)胞的遲發(fā)性生長障礙。提示短時間的高濃度氧可能對未成熟腦產(chǎn)生一定損傷。但24 h 80%高氧引起未成熟腦海馬區(qū)域的星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡，可能與高濃度氧損傷時間過短以及海馬區(qū)域相對于腦內(nèi)其他區(qū)域可能具有一定的抗凋亡能力有關(guān)。

圖2 不同日齡新生大鼠海馬DG、Hilus和CA1區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖情況

氧氣療法通過給予高濃度氧氣吸入氧提高肺泡內(nèi)的氧分壓，改善血氧飽和度，維持良好的呼吸功能，能夠及時糾正低氧血癥和高碳酸血癥，因此，氧療已經(jīng)成為治療早產(chǎn)兒窒息缺氧的重要措施之一。目前已經(jīng)證實高濃度氧會引起視網(wǎng)膜病變[3]和慢性肺部疾病[4]，同時國內(nèi)外研究[5-6]提示高濃度氧可能會加重新生兒腦損傷，從而增加神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的發(fā)生率。課題組前期實驗已證實24 h 80%高氧引起未成熟腦內(nèi)海馬區(qū)域神經(jīng)元細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)的早期生長增殖障礙，而本研究也顯示24 h 80%高氧引起未成熟腦海馬區(qū)域的星形膠質(zhì)細(xì)胞的早期生長增殖障礙，因此進(jìn)一步證實即使24 h短時間高濃度氧同樣可能引起早期神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育異常。星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多的神經(jīng)細(xì)胞，保證正常的血腦屏障，提供神經(jīng)元足夠的營養(yǎng)支持，維持腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)和細(xì)胞外離子環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。在感染、缺氧窒息等病理狀態(tài)下，活性星形膠質(zhì)細(xì)胞是膠質(zhì)增生的主要參與者，并且和脫髓鞘病變及軸損傷有密切聯(lián)系[7]。有研究[5]表明48 h 80%高濃度氧抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性，減少其增殖并加重細(xì)胞凋亡。本研究中顯示24 h 80%高濃度氧引起未成熟腦海馬區(qū)域的星形膠質(zhì)細(xì)胞的早期增殖障礙，但僅在hilus區(qū)域和DG區(qū)域的星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖異常差異有統(tǒng)計學(xué)意義，可能和海馬區(qū)域的選擇性損傷特點(diǎn)有關(guān)[8]。在缺氧缺血性腦損傷中相比較海馬其他區(qū)域，hilus區(qū)域中的hilar神經(jīng)元以及CA1區(qū)域中的椎體神經(jīng)元極易損傷[8]，本研究中高濃度氧的海馬區(qū)域損傷也發(fā)生在這兩個區(qū)域。除此以外，高氧引起未成熟腦早期海馬hilus區(qū)域星形膠質(zhì)細(xì)胞的遲發(fā)性生長障礙，提示即使短時間高濃度氧仍可能引起遠(yuǎn)期神經(jīng)細(xì)胞損傷。

圖3 不同日齡新生大鼠海馬DG、Hilus和CA1區(qū)凋亡情況

有研究[9]顯示高氧通過不同的凋亡路徑引起未成熟腦內(nèi)廣泛細(xì)胞凋亡，但本研究中顯示24 h 80%高氧刺激后海馬DG、hilus和CA1區(qū)域凋亡細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度在早期及成熟期日齡中均較對照組無統(tǒng)計學(xué)上的變化，提示24 h 80%高氧并未引起未成熟腦海馬區(qū)域的星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡。有學(xué)者[10]早在1998年就發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果，在暴露大鼠在95%高氧中5 d后發(fā)現(xiàn)在腦內(nèi)基底節(jié)和紋狀體區(qū)域出現(xiàn)細(xì)胞凋亡增多，但海馬區(qū)域無明顯細(xì)胞凋亡。這些提示未成熟腦內(nèi)不同區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞的抗凋亡能力不同，可能海馬區(qū)域相比較腦內(nèi)其他區(qū)域具有更強(qiáng)的抗凋亡能力。