350份小麥種質(zhì)的SSR遺傳多樣性分析

鄭永勝，王麗媛，段麗麗，王暉，王穆穆，李華，王瑋，耿慧晶，張晗，李汝玉

（山東省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所，山東濟南 250100）

小麥（Triticum aestivum L.）是一種適應性強且分布廣泛的世界性重要糧食作物，在植物學分類上屬于禾本科（Poaceae）小麥族（Triticeae）小麥屬（Triticum）。小麥是我國三大糧食作物之一，在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及國民經(jīng)濟中占有重要地位，其產(chǎn)量水平對國家糧食生產(chǎn)至關重要。然而，由于育種過程中選用的親本來源較為單一，近年來小麥育成品種的產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性均受到一定程度限制，種質(zhì)改良進展緩慢［1，2］。

簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR）是以1～6個核苷酸為重復單位的串聯(lián)重復序列，是以PCR擴增技術為基礎的DNA標記。SSR標記多數(shù)是共顯性標記，符合孟德爾遺傳定律，可以有效地區(qū)分雜合或純合基因型，同時具有多態(tài)性高、重復性好、操作簡單等優(yōu)點，在遺傳多樣性檢測等方面廣泛應用［3，4］。SSR標記已廣泛應用于植物遺傳多樣性分析，在水稻［5］、高粱［6］、甘薯［7］、大白菜［8］、菜豆［9］等作物中均有相關報道。小麥中，于明寨等［3］選用64對SSR引物對73個冬小麥親本材料進行遺傳多樣性分析，結果表明本地育成品種遺傳背景相似度較高；鄭軍等［10］通過SSR標記對山西省162份小麥品種進行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)2000—2005年審定品種的遺傳多樣性最高；張彥軍等［11］利用150個SSR引物分析43份不同來源的和尚頭小麥種質(zhì)材料，將其劃分為8個組群，認為這些種質(zhì)資源具有豐富的遺傳多樣性。本研究利用37對SSR引物對2012—2017年進行新品種保護的350份小麥種質(zhì)材料進行遺傳多樣性分析，旨在從分子水平上為小麥品種選育、種質(zhì)創(chuàng)新和品種鑒定提供一定科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的350份小麥種質(zhì)材料為2012—2017年間進行新品種保護的小麥品種，多來源于黃淮地區(qū)（表1）。

1.2 基因組DNA提取

取幼嫩葉片0.2 g，放入1.5 mL離心管中，在液氮中研碎。將DNA提取液預熱到65℃，向每管中加入400μL，混勻；將離心管置于65℃金屬浴或水浴鍋中保溫30 min后取出；向離心管中加入氯仿-異戊醇（體積比為24∶1）400μL，振蕩混勻，10 000×g離心10 min；將上清液200μL轉(zhuǎn)入另一只1.5 mL離心管，加入-20℃預冷無水乙醇400μL沉淀DNA，再10 000×g離心1 min，棄上清，加入乙醇-乙酸銨溶液500μL，6 000×g離心5 min收集沉淀。加入TE溶液（pH 8.0）100 μL溶解DNA，通過Nanodrop 2000分光光度計測定濃度與OD260／OD280值，檢測DNA純度；用1%瓊脂糖凝膠電泳評估DNA完整性，-20℃保存。

表1 供試的350份小麥種質(zhì)資源

表1 （續(xù)）

1.3 SSR引物合成與梯度PCR擴增

PCR反應所使用的SSR引物根據(jù)課題組前期篩選結果［12］，利用2%的瓊脂糖凝膠電泳進行初步篩選，并從中篩選出擴增條帶清晰、可重復、多態(tài)性好且均勻分布于小麥21對染色體上的37對引物用于本研究。引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。本研究所用PCR反應體系及梯度PCR擴增反應程序參考段麗麗等［8］的試驗方法。

1.4 熒光毛細管電泳檢測

在37對引物的5′端加入6-FAM（藍色）、HEX（綠色）、TAMRA（黑色）和 ROX（紅色）中的一種熒光標記，6-FAM和HEX熒光標記的PCR產(chǎn)物分別稀釋30倍，TAMRA和ROX熒光標記的PCR產(chǎn)物分別稀釋10倍，然后分別取等體積的上述4種稀釋液進行混合，隨后使用ABI 3730 XL型DNA分析儀進行毛細管電泳檢測。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用 GeneMapper軟 件 （https：／／www.thermofisher.com／）對毛細管電泳檢測結果進行圖像分析和數(shù)據(jù)采集，無效等位變異記錄為0／0。利用PowerMarker V3.25［13］軟件分析每對引物擴增條帶結果，計算每對引物的等位基因數(shù)（number of alleles，A）、主要等位基因頻率（major allele frquency，M）、基因多樣性指數(shù)（gene diversity index，GDI）和多態(tài)性信息含量（polymorphic information content，PIC），計算 Nei氏遺傳距離；采用鄰近法（neighbor joining，NJ）進行遺傳聚類分析，繪制聚類樹狀圖。

2 結果與分析

2.1 SSR標記的遺傳多樣性分析

利用37對SSR引物對350份小麥種質(zhì)進行擴增，共檢測到288個等位基因變異。由表2可以看出，每對SSR引物檢測的等位基因數(shù)差異較大，變異范圍為2～14個，平均每對引物檢測到7.784個等位基因，其中有10對引物擴增出10個及以上的等位基因。37對引物的主要等位基因頻率相差較大，引物xgwm445的主要等位基因頻率最大，為0.849；引物barc4的主要等位基因頻率最小，為0.309；所有引物的主要等位基因頻率平均值為0.481。37對SSR引物的基因多樣性指數(shù)分布范圍為0.268～0.807，平均值為0.653，引物cfd76的最大，xgwm445的最小。多態(tài)性信息含量（PIC）是用來衡量遺傳標記座位多態(tài)性信息量的指標，37對 SSR位點的平均 PIC值為0.608，變幅為0.250～0.785，引物cfd76的最高，xgwm445的最低。綜上所述，供試350份小麥種質(zhì)材料的遺傳多樣性較高。

表2 37對SSR引物的多態(tài)性信息

2.2 350份小麥種質(zhì)的遺傳距離分析

遺傳距離指不同的種群或種之間基因差異的程度，是用來衡量物種之間或同一物種不同群體之間遺傳分化的指標。本研究中350份小麥種質(zhì)間的Nei氏遺傳距離在0～0.957之間，平均值為0.649，表明多數(shù)小麥種質(zhì)間遺傳差異較大，親緣關系相對較遠。在350份小麥種質(zhì)兩兩間遺傳距離比較中發(fā)現(xiàn)，‘輪選526’與‘鄭麥369’間遺傳距離最大（0.957），兩者間親緣關系最遠；有6組品種間遺傳距離為0，遺傳相似度最高，這6組材料分別是‘百農(nóng)矮抗58’與‘冀麥38’、‘濟麥19’與‘中麥13’、‘九麥2號’與‘雙麥998’和‘周麥16’、‘輪選496’與‘輪選 987’和‘前 A182’、‘豫麥49’與‘豫麥49-198系’、‘鄭優(yōu)6號’與‘周麥22號’。查詢這些材料的遺傳來源發(fā)現(xiàn)多為共同親本或相近親本材料選育而來，目前所選的37對分子標記不足以明顯區(qū)分開這些材料，需要繼續(xù)挖掘代表性標記。

2.3 350份小麥品種的系統(tǒng)聚類分析

使用 PowerMarker V3.25軟件，根據(jù)37對SSR引物所檢測的288個等位變異位點數(shù)據(jù)計算得到Nei氏遺傳距離，采用NJ方法進行聚類。參試的350份小麥種質(zhì)可分為4大類群，第Ⅰ類（紅色分支）包括33份種質(zhì)，第Ⅱ類（藍色）包括83份種質(zhì)，第Ⅲ類（綠色）包括76份種質(zhì)，第Ⅳ類（紫色）包括158份種質(zhì)（圖1）。

根據(jù)遺傳背景來看，親緣關系相同或相近的材料遺傳相似系數(shù)較高，在聚類圖中也明顯聚在一起。如第Ⅰ類群中，‘冀麥585’和‘冀麥518’最先聚在一起，它們均由太谷核不育群體選育而來；‘石新828’和‘石新633’聚在一起，它們均由‘石新733’與其他材料雜交選育而來。第Ⅱ類群的品種多以矮敗小麥輪選群體材料為親本進行有性雜交選育而成，如共同親本‘輪選987’‘輪選496’‘輪選9873’等。第Ⅳ類群的品種多是由‘矮抗58’‘周麥16’等親本衍生而來，如‘鄭品麥8號’‘周麥32號’‘豐德存麥1號’‘冀麥38’‘錦繡21’‘洛麥28’‘棗鄉(xiāng)158’‘洛麥31’‘開麥22’‘周麥33號’等16個材料與‘矮抗58’聚為一支。

圖1 基于SSR標記的350份小麥種質(zhì)材料聚類結果

3 討論與結論

種質(zhì)資源是育種工作的基礎，而遺傳多樣性又是種質(zhì)資源創(chuàng)新和改良的基礎，也是種質(zhì)資源研究的主流［14］。研究小麥種質(zhì)資源的遺傳多樣性，可為小麥品種選育、種質(zhì)創(chuàng)新和品種鑒定提供理論依據(jù)，對于促進小麥育種水平的提高具有重要意義［2］?；蚨鄻有灾笖?shù)和多態(tài)性信息含量是用來衡量種群遺傳多樣性的指標，多態(tài)性信息含量（PIC）超過0.5時，遺傳位點多態(tài)性較高；低于0.25時，則遺傳位點多態(tài)性程度較低。本研究所有SSR位點的PIC平均值達0.608，其中有31對引物的PIC大于0.500，占所有引物的83.8%；同時本研究中34對（91.89%）引物的基因多樣性指數(shù)大于0.500。遺傳距離是另一個用來衡量物種或群體之間遺傳分化的指標，本研究350份小麥種質(zhì)間的Nei氏遺傳距離平均值為0.649，這與侯丞志等［15］的研究結果相似，但與其他研究結果相比相對較高［3，16-20］。綜上所述，37對 SSR引物在350份小麥種質(zhì)中的多態(tài)性位點具有很大的變化幅度，且多態(tài)性較高的位點較多；350份試驗材料的遺傳變異豐富，具有豐富的遺傳多樣性。

聚類分析是研究不同種質(zhì)資源間遺傳差異的重要方法，可以為雜交育種過程中的親本選配提供參考［21］。本研究中不同來源的350份小麥種質(zhì)聚為4大類，有共同親本或由同一育種單位育成的品種親緣關系較近，通常聚為一類；但也有一些具有相同的一個或多個親本材料的種質(zhì)材料分散在不同的類群，可能原因是雜交選育的子代品種僅繼承了單一親本的遺傳信息。綜合比較350份小麥種質(zhì)的系譜發(fā)現(xiàn)，這些材料的親本來源信息多集中于幾個骨干親本，如太谷核不育群體、‘輪選987’‘矮抗58’‘周麥16’等。在今后的小麥育種中，應選用遺傳背景差異大、遺傳基礎寬的親本，有利于優(yōu)異性狀的聚合，促進種質(zhì)創(chuàng)新，豐富小麥品種的遺傳多樣性［19，22］。