基于不同基質刺芹側耳菌絲生長與木質素降解酶的相關性研究*

趙翠敏，杜 芳，鄒亞杰，胡清秀，鄭素月

（1.河北工程大學園林與生態(tài)工程學院，河北 邯鄲 056000；2.中國農業(yè)科學院農業(yè)資源與農業(yè)區(qū)劃研究所，北京 100081）

我國是農業(yè)生產大國，每年都會有大量的秸稈類、修枝類等農林廢棄物產生。這些農林廢棄物大多富含木質纖維素，是來源豐富、成本低廉、再生時間短的生物質資源，其堆積不僅會造成環(huán)境污染，而且是一種巨大的資源浪費[1-2]。食用菌屬于大型真菌，可以以富含木質纖維素的材料為主要培養(yǎng)料[3]，通過分泌一系列胞外酶將纖維素和半纖維素物質分解為可供菌體直接吸收利用的小分子碳源。但在木質纖維素中，纖維素、半纖維素和木質素相互交聯(lián)，形成牢固的網絡結構[4]。纖維素及半纖維素很容易被環(huán)境中的微生物降解，但木質素卻不容易被分解。降解木質素能有效地促進纖維素、半纖維素的釋放，是木質纖維素物質高效利用的關鍵。參與木質素降解的酶系主要由木質素過氧化物酶（lignin peroxidase,LiP）、錳過氧化物酶（manganese peroxidase,MnP）和漆酶（laccase）等組成，這些酶類合稱為木質素降解酶或木質素酶[5-6]。

刺芹側耳 [Pleurotus eryngii(DC.et Fr.)Quèl.]，又名杏鮑菇，隸屬于傘菌目（Agaricales） 側耳科（Pleurotaceae） 側耳屬 （Pleurotus），是一種白腐真菌，具有較強的木質纖維素降解能力，可以在木屑、甘蔗渣、棉籽殼、玉米芯等多種農林廢棄物上生長[7]。真菌對基質的利用和轉化能力可以用其木質纖維素降解酶的活性來指示。鞠洪波[8]研究報道杏鮑菇對云杉木質素的降解能力在香菇、金針菇、平菇等9種食用菌中最強，而從多種新鮮食用菌子實體中提取漆酶，發(fā)現(xiàn)杏鮑菇漆酶的酶活性最高[9-10]，工廠化杏鮑菇菌渣漆酶活性最高可以達到7.55×104U·g-1，明顯高于桃紅側耳、香菇、白靈菇菌渣中的漆酶活性[11]。由此可見，杏鮑菇之所以生長速度快、生產周期短、易于栽培，除了其本身的生物學特性之外，還與其能夠分泌高活性的木質素酶類緊密關聯(lián)[12]。但在杏鮑菇的生產過程中，不同農林廢棄物誘導菌絲體生產木質素酶類的酶活水平尚不清楚。通過以刺芹側耳2611為試驗材料，研究其在7種農林廢棄物培養(yǎng)基質上的菌絲生長速度，并且測定其液體發(fā)酵胞外產漆酶、木質素過氧化物酶的情況變化，探索刺芹側耳對不同栽培基質的降解利用規(guī)律，為優(yōu)化刺芹側耳新型栽培基質提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

刺芹側耳（Pleurotus eryngii）2611，來自于中國農業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏號ACCC52611。

1.1.2 供試材料

棉籽殼、木屑、玉米芯、玉米秸稈、甘蔗渣、花生殼、檸條7種農林廢棄物，各栽培基質中的纖維素、半纖維素和木質素的含量[13-16]如表1所示。

表1 供試原料及組成Tab.1 Test material and composition

1.1.3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：15.6 g DifcoTM Potato Dextrose A－gar（美國 BD公司） 溶于 400 mL的 ddH2O中，121℃滅菌 15 min。

農林廢棄物培養(yǎng)基各組分見表2。

表2 培養(yǎng)基組分Tab.2 The medium formula

如表2所示，固體和液體培養(yǎng)基組分相同，固體培養(yǎng)基配制時加入20 g·L-1的瓊脂。定容至1 L，121℃，滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 平板培養(yǎng)試驗

從PDA平板上取0.5 cm×0.5 cm菌種塊接種于不同基質的固體培養(yǎng)基的平板。28℃恒溫黑暗培養(yǎng)5 d觀察記錄菌絲生長情況，并測定菌絲生長速度。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)試驗

在250 mL的三角瓶中加入100 mL相應的發(fā)酵液滅菌，在無菌環(huán)境中每瓶接種10 mL的原種，置于28℃搖床內黑暗振蕩（180 r·min-1）培養(yǎng)5 d。原種由2個剛長滿菌絲90 mm×90 mm PDA平板加入100 mL農林廢棄物培養(yǎng)基中，經勻漿儀20 s混勻得到。

1.2.3 粗酶液制備

將發(fā)酵液轉移至離心管中，12 000 r·min-1離心10 min，上清液即為粗酶液樣品。

1.2.4 漆酶活性測定

ABTS法測定發(fā)酵液漆酶酶活[17]。將100 μL的粗液樣品與190 μL的底物ABTS混勻，30℃反應10 min后，加入300 μL的5℅ TCA溶液終止反應，420 nm處測定OD值。滅活酶液作為對照，對照管提前終止。酶活單位定義為每分鐘氧化1 μmol底物所需的酶量為一個酶活力單位（U·mL-1），漆酶活力（E，U·mL-1）計算公式為：

式中：ε為ABTS摩爾消光系數（36 000 L·mol-1cm-1）；Δt為酶反應時間（min）；ΔOD為吸光度的變化值；V1為酶反應中反應液的總體積（mL）；V2為酶反應中，酶液的總體積（mL）；N為酶液稀釋倍數。

1.2.5 木質素過氧化物酶活性測定

木質素過氧化物酶活性的測定使用北京索萊寶生物科技有限公司的木質素過氧化物酶試劑盒。每個處理3個生物學重復。酶活性定義：每升培養(yǎng)液每分鐘氧化1 nmol藜蘆醇所需的酶量為一個酶活力單位。木質素過氧化物酶活性（P，nmol·min-1L-1）計算公式為：

式中：ε為藜蘆醛摩爾消光系數，9 300 L·mol-1cm-1；d為比色皿光徑1 cm；V反總為反應總體積1 mL；V樣為反應中樣本體積0.1 mL；T為反應時間5 min；ΔA為OD310的變化值。

1.2.6 數據分析

生長速度、酶活和生物量變化數據均為3次重復試驗的平均值±標準偏差（SD），小寫字母為使用IBM SPSS Statistics 25軟件計算的顯著性差異（P<0.05），采用Duncan方法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基質對菌絲生長的影響

不同栽培基質上的菌絲生長速度、生長勢和菌絲的濃密度不同，見圖1、表3。

表3 不同基質對菌絲長勢的影響Tab.3 The effects of different media on mycelium growth

從圖1、表3可以看出，在玉米芯基質上，菌絲生長速度最快（5.49 mm·d-1），且菌絲整齊濃密，長勢良好；其次菌絲生長速度由快到慢依次是玉米秸稈、甘蔗渣、木屑、花生殼、檸條、棉籽殼。其中玉米秸稈基質生長速度（4.96 mm·d-1）和甘蔗渣基質生長速度（4.84 mm·d-1）差異不顯著，木屑基質生長速度（4.63 mm·d-1）和花生殼基質（4.62 mm·d-1）沒有顯著差異。甘蔗渣基質上菌絲稀疏，菌絲較均勻。綜合菌絲生長速度、菌絲濃密度、菌絲均勻度分析，以棉籽殼、檸條、甘蔗渣為碳源的培養(yǎng)基質杏鮑菇的菌絲長勢明顯弱于以其他材料為碳源基質的杏鮑菇菌絲長勢，說明以玉米芯、木屑、玉米秸稈和花生殼為碳源有利于菌絲的生長，杏鮑菇對4種基質的降解利用效果更好。

2.2 不同培養(yǎng)基質誘導菌絲體產漆酶的能力比較

不同培養(yǎng)基質液體發(fā)酵液中的漆酶酶活性有顯著的差異，見表4。

表4 不同基質對漆酶酶活的影響Tab.4 The effects of different substrates on laccase activity

從表4可以看出，在花生殼培養(yǎng)基質中，漆酶的酶活最高（109.15 U·mL-1），其它培養(yǎng)基質中漆酶酶活由高到低依次是玉米秸稈、玉米芯、木屑、檸條、甘蔗渣、棉籽殼，在棉籽殼培養(yǎng)基質中漆酶酶活最低（30.08 U·mL-1）。其中玉米芯基質中的漆酶酶活（76.62 U·mL-1）與玉米秸稈基質中的漆酶酶活（86.62 U·mL-1）無顯著差異，木屑基質中的漆酶酶活（63.73 U·mL-1）與檸條基質中的漆酶酶活（57.60 U·mL-1）差異也不顯著。白腐菌的生長與漆酶的分泌具有一定的相關性，一般情況下，生長狀況良好的白腐菌分泌的漆酶酶活性高，生長狀況差的白腐菌分泌的漆酶酶活性低，但是白腐菌的生長和產漆酶并不同步，沒有明顯的正相關性[18]。在本研究中，杏鮑菇在花生殼、玉米秸稈、玉米芯基質中分泌漆酶的酶活性高，而在棉籽殼、檸條、甘蔗渣基質中分泌胞外漆酶的酶活性低。和已有的研究結果基本一致，漆酶的酶活性與菌絲長勢相關，菌絲長勢越好漆酶酶活越高[19]。

2.3 不同培養(yǎng)基質誘導菌絲體產木質素過氧化物酶的能力比較

不同培養(yǎng)基質液體發(fā)酵液中的的木質素過氧化物酶的酶活性有顯著的差異，見表5。

表5 不同基質對木質素過氧化物酶酶活的影響Tab.5 The effects of different substrates on lignin peroxidase activity

從表5可以看出，在玉米芯培養(yǎng)基質中，木質素過氧化物酶的酶活性最高（6.02 nmol·min-1L-1）。其它培養(yǎng)基質中木質素過氧化物酶的酶活性由高到低依次是玉米秸稈、花生殼、棉籽殼、木屑、甘蔗渣、檸條。其中玉米芯培養(yǎng)基質中的酶活性（6.02 nmol·min-1L-1）與玉米秸稈培養(yǎng)基質中的酶活性（5.23 nmol·min-1L-1）無顯著差異，甘蔗渣培養(yǎng)基質中的酶活性（0.86 nmol·min-1L-1）與檸條培養(yǎng)基質中的酶活性（0.26 nmol·min-1L-1）無顯著差異。檸條培養(yǎng)基質中酶活性最低（0.26 nmol·min-1L-1）。木質素過氧化物酶活性在檸條、甘蔗渣、木屑、棉籽殼的培養(yǎng)基中，活性明顯低于其它培養(yǎng)基。以上結果表明，胞外木質素過氧化物的酶活性與菌絲長勢具有一定的相關性，酶活越高菌絲長勢越好。

3 討論

通過對刺芹側耳在不同培養(yǎng)基質上菌絲生長速度、菌絲的長勢和胞外酶的變化規(guī)律進行研究，發(fā)現(xiàn)不同培養(yǎng)基質對菌絲的生長和木質素降解酶的活性均有明顯影響（P<0.05）。菌絲長勢參差不齊、菌絲生長速度差異大，在玉米芯基質上菌落最大，菌絲濃密，其次是玉米秸稈基質，說明玉米的廢棄物適合刺芹側耳菌絲的生長。已有研究表明食用菌菌絲的生長速度不僅與栽培料的C/N和N濃度有關，更與栽培料種類及其透氣性密切相關；菌絲生長良好是食用菌高產的基礎，但是不同栽培基質的菌絲滿袋時間及菌絲濃密度與其產量相關性不顯著，菌絲的生長情況與產量不呈正相關[20-22]。根據本研究結果，可以在杏鮑菇的生產中栽培基質中加入合適比例的玉米芯和玉米秸稈將有助于菌絲的生長。

漆酶是與木質素等大分子物質降解有關的主要酚氧化酶，在木質素的分解過程中起著重要的作用，屬于誘導酶類，其活性會受到諸多因素的影響，如碳源、氮源、金屬離子和激活物、pH及菌株等[20]。雜木屑、棉籽殼、玉米芯、甘蔗渣都是食用菌生產的主要碳源，其都含有大量的木質素，但含量不同，木質素含量高更有利于漆酶的誘導表達[23]。韓嘉鈺等[24]對不同栽培基質對靈芝胞外酶活的影響開展研究，發(fā)現(xiàn)在菌絲生長階段玉米芯培養(yǎng)基質中漆酶的酶活性比棉籽殼和木屑中的漆酶酶活性要高，與本試驗結果一致。趙風云等[25]研究以蔗渣和棉籽殼為基質的靈芝酶活性中，發(fā)現(xiàn)棉籽殼培養(yǎng)基質中的漆酶酶活性高于蔗渣，與本試驗中甘蔗渣漆酶酶活性高于棉籽殼結果不一致。安琪等[26]針對不同碳源和氮源開展對金針菇降解木質纖維素酶活性的影響的研究，表明與纖維素酶和半纖維素酶相反，金針菇在復雜氮源培養(yǎng)基上生長時漆酶活性相應低于簡單氮源培養(yǎng)基。在本研究中，花生殼培養(yǎng)基質中漆酶的酶活性最高（109.15 U·mL-1），棉籽殼基質中漆酶酶活最低（30.08 U·mL-1）?；ㄉ鷼さ哪举|素含量最高，菌絲生長需要分泌更多的漆酶來降解木質素，因此在花生殼培養(yǎng)基質中酶活最高。但是棉籽殼的木質素含量在7種農林廢棄物中不是最低的。木質素含量只是其中一個因素，不是決定性的因素，可能還和栽培基質的結構等其它因素有關。

木質素過氧化物酶是第一個從黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium） 發(fā)現(xiàn)的木質素降解酶，在木質素降解中起關鍵性作用[27]。丁少軍等[28]研究了不同培養(yǎng)條件對云芝木質素降解酶產量的影響，發(fā)現(xiàn)木質素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶的產生與培養(yǎng)條件關系很大。彭木等[29]在研究帽兒山采集的禪剝管菌時表明不同底物能極大地刺激相應酶的產生與分泌。據報道，木質素含量越高越能促進木質素分解酶的產生[30]。在本研究中，玉米芯培養(yǎng)基質中木質素過氧化物酶的酶活性達到最高（6.02 nmol·min-1L-1），檸條培養(yǎng)基質中木質素過氧化物酶的酶活性最低（0.26 nmol·min-1L-1）。總體來看，除了少數差異以外，木質素過氧化物酶的酶活性與漆酶的酶活性表達趨勢基本一致。

綜上所述，通過對刺芹側耳在不同培養(yǎng)基質上菌絲生長勢、長速分析并進行了對應的液體培養(yǎng)，測定了木質素降解的關鍵酶，初步明確了不同種類的農林廢棄物的木質纖維素的組成影響刺芹側耳的降解能力，哪種類型的農林廢棄物更有利于刺芹側耳的吸收利用，為進一步篩選適宜刺芹側耳利用生長的栽培基質提供參考。