豬苓菌絲體化學(xué)成分在運動性水腫中的作用*

龐兵武

（鐵道警察學(xué)院，河南 鄭州 450003）

豬苓（Polyporus umbellatus） 又名豬茯苓、豬靈芝、野豬糞、朱苓等，是多孔菌科（Polyporaceae）多孔菌屬（Polyporus） 真菌[1]。豬苓多為野生，寄生在樺樹、楓樹和橡樹等樹木的根部，前期生長于地下土壤中，豬苓菌核拱出地面生長，可人工栽培[2]。若子實體幼嫩時可以作為食用菌食用，營養(yǎng)豐富、味道鮮美。豬苓也是一味常見的中藥，自古就被記載有利尿治水腫之功效[3]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》列為中品、中醫(yī)認(rèn)為其“性甘平，入腎、膀胱經(jīng)”，主治腎炎，小便不利，水腫等疾病[4]。現(xiàn)在豬苓已經(jīng)成為一種常用的藥用真菌，“五苓散”“豬苓湯”等中藥方中均大量使用。

已有人在豬苓中提取到無晶形多糖、麥角甾醇等多種活性物質(zhì)和微量元素[5]。陳曉梅等[6]從豬苓中分離得到豬苓多糖、28個甾體類化合物、三萜類、蒽醌類和腺嘌呤核苷等12種其它化合物；曾星等[7]研究了豬苓多糖對膀胱癌的治療；戴如琴等[8]研究了豬苓菌絲體的抗腫瘤功效，這些研究都表明，豬苓子實體和菌絲中均含有抗癌、抗腫瘤成分。

現(xiàn)代人重視健身運動，一些人在做完運動之后時常會出現(xiàn)水腫現(xiàn)象，而且多是下肢水腫，嚴(yán)重的軀體也會浮腫[9]。主要是運動負(fù)荷過大或發(fā)力不對，對下肢造成壓力過大，局部乳酸堆積或細(xì)胞壁破損造成運動型水腫[10]。在排除自身器官問題后，可以采用冷敷、熱療的方法，同時，也需要通過藥物和飲食調(diào)節(jié)來加快水腫的消退。

1 材料和試驗方法

1.1 材料

1.1.1 豬苓菌株

豬苓菌株購自標(biāo)準(zhǔn)品信息網(wǎng)，菌絲白色，生長緩慢，20 d菌絲生長約1 cm。

1.1.2 培養(yǎng)基

綜合PDA瓊脂培養(yǎng)基：馬鈴薯提取液1.0 L，葡萄糖 20.0 g；磷酸二氫鉀 3.0 g、七水硫酸鎂 2.0 g、VB10.5 g；瓊脂 15.0 g。

1.1.3 藥品與試劑

95%乙醇，無水乙醇，正丁醇，三氯乙酸，鹽酸、氫氧化鈉等均為分析純；戊巴比妥鈉，紅霉素軟膏均為醫(yī)用。

1.1.4 試驗儀器

JZ-BS恒溫培養(yǎng)箱，北京九州晟欣科技有限公司；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱，泰安市宇成礦用設(shè)備有限公司；WACS-1045型全自動微電腦高壓滅菌鍋，成都浩宇馳儀器儀表有限公司；YP102N精密電子天平秤，北京佳航博創(chuàng)科技有限公司；VD-650桌上式垂直送風(fēng)凈化工作臺，上海坤誠科學(xué)儀器有限公司；YG600型恒溫水浴振蕩器，南通三思機(jī)電科技有限公司；GT10-2高速臺式離心機(jī)，北京金洋萬達(dá)科技有限公司；XPM-120*3實驗室三頭研磨機(jī)，江西龍中機(jī)械設(shè)備有限公司；DZF-6090D真空干燥箱，常州金壇良友儀器有限公司，SY-1000E型恒溫聚能式超聲波提取機(jī)，上海仙象儀器儀表有限公司；TJSM－2000-Ⅱ型高頻電刀，天津市賽盟醫(yī)療科技有限公司；faith-4060型全自動生化分析儀，南京勞拉電子有限公司。

1.1.5 試驗動物

試驗采用雌雄各半的白兔，體重 （2.4±0.4） kg，購自天津裕達(dá)實驗動物繁育有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK（津） 2016-0001。

1.2 豬苓菌絲體培養(yǎng)

1.2.1 PDA 培養(yǎng)基制備方法

馬鈴薯提取液制備：采用去皮馬鈴薯200 g，切成2 cm左右的小塊，加純凈水1.0 L煮30 min，期間不停攪拌防止糊底；煮成糊狀后自然冷卻至室溫，用3層紗布包裹，用力擠壓過濾；取濾液，加入葡萄糖、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、維生素和瓊脂，攪拌均勻并加水定容至1.0 L即可，pH自然。

1.2.2 豬苓菌絲活化培養(yǎng)方法

購買的豬苓菌種在冰箱2℃～4℃冷藏24 h后取出，在固體斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行接種；接種后放入恒溫培養(yǎng)箱中27℃避光培養(yǎng)7 d，之后再進(jìn)行1次篩選，選出適合生長的培養(yǎng)基再進(jìn)行1次轉(zhuǎn)接；繼續(xù)觀察，當(dāng)斜面上菌絲體覆蓋滿時即可。好的豬苓菌絲呈白色、生長均勻稠密。

在500 mL三角瓶中裝入200 mL的PDA培養(yǎng)基，滅菌處理后接入斜面培養(yǎng)的豬苓菌絲塊3片～5片，每片菌絲塊約5 mm，分散放置，調(diào)節(jié)pH至5.0。然后將三角瓶放入 恒溫水浴振蕩器，27℃、140 r·min-1發(fā)酵 7 d。

1.3 豬苓菌絲體化學(xué)成分提取

采用“乙醇+超聲波”聯(lián)合提取法提取豬苓菌絲體化學(xué)成分。將活化培養(yǎng)好的豬苓菌絲裝入試管，加等量的PDA培養(yǎng)基，置于恒溫水浴振蕩器中，27℃、140 r·min-1振蕩培養(yǎng)4 d。得到的發(fā)酵液在5 000 r·min-1離心15 min，取下部的菌絲體，用純凈水洗滌后，放入真空干燥箱，60℃下烘干至恒重，研磨機(jī)200 r·min-1研磨10 min得到豬苓菌絲體粉末。

將豬苓菌絲體干粉末中按1∶40的料液比加純凈水進(jìn)行超聲波提取，超聲功率為120 W、60℃提取15 min，連續(xù)提取2次，合并2次提取液，得到豬苓菌浸提液。

將正丁醇與三氯乙酸按5∶1的比例混合配制成混合液，并按1∶1的比例加入豬苓浸提液混勻。置于恒溫水浴振蕩器中140 r·min-1、27℃振蕩20 min，取出后靜置30 min。再加入2倍體積的95%乙醇溶液洗滌后，放入4℃冰箱靜置48 h；取出后將下層沉淀物上離心機(jī)，5 000 r·min-1離心15 min，再將離心后的沉淀物用無水乙醇洗滌3次；最后放入真空干燥箱，60℃真空干燥至恒重即得豬苓菌絲體提取物。該提取物中含有多糖、蛋白質(zhì)、甾體類和酮類等多種化學(xué)成分，是豬苓藥效的主要來源。用該提取物按1∶1制備成豬苓菌絲體提取液供動物試驗使用。

1.4 運動水腫試驗方法

將20只兔子單籠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分成高劑量組、中劑量組、低劑量組，1個對照組，每組5只，繼續(xù)單籠飼養(yǎng)。

用1.5%的戊巴比妥鈉，按3 mL·kg-1劑量在兔耳邊緣靜脈注射麻醉兔子，約5 min～10 min兔子安靜后固定在超凈工作臺上；從一側(cè)后肢小腿關(guān)節(jié)上3 cm位置，剔除上下3 cm的毛發(fā)后進(jìn)行皮下環(huán)切；切除約3 cm寬的皮膚、注意不要傷及肌肉和肌腱、神經(jīng)組織。用電刀灼燒裸露皮膚，再用紅霉素軟膏涂抹1層灼燒后的皮膚，防止感染。將切除皮膚的后肢環(huán)切區(qū)用銫137輻射，采用一次性輻射10 GY劑量的照射。1 d～3 d后觀察兔子環(huán)切處出現(xiàn)水腫并不斷增大，3 d左右水腫體積基本穩(wěn)定時即表明水腫模型建立成功。

兔子水腫模型建立后，每天固定給高劑量組、中劑量組、低劑量組兔子分別灌胃90 mL、60 mL和30 mL配制好的豬苓菌絲體提取液，對照組灌胃同等劑量的生理鹽水，連續(xù)30 d。

采用排水法測量水腫情況，將兔子水腫的后肢浸入裝滿生理鹽水量杯中，浸水深度與大腿關(guān)節(jié)齊平。拿出后計算排出的生理鹽水的排出量即為水腫腿體積；同樣測量出另外一側(cè)未環(huán)切后肢的體積，每3天測量1次，每次3個重復(fù)，連續(xù)30 d。

收集灌胃后2 h內(nèi)的兔子尿液，用量筒測量比較各組的總尿量。并采用全自動生化分析儀測定各組混合尿液中的銨根陽離子和鈉離子含量。

2 試驗結(jié)果

2.1 水腫體積變化

由于受到了輻射，在術(shù)后兔子均很快產(chǎn)生了水腫，3 d左右基本穩(wěn)定。各組兔子水腫包直徑的變化情況如圖1所示。

由圖1可知，術(shù)后1周內(nèi)各試驗組和對照組的水腫程度基本相同，從第5天起出現(xiàn)變化，與對照組相比，中劑量組、高劑量組水腫體積顯著減?。≒<0.05）；后續(xù)2周內(nèi)，低劑量組的水腫體積無明顯變化，中劑量組、高劑量組顯著減?。≒<0.05）；最后1周，低劑量組的水腫程度下降較大，但差異不明顯，中劑量組、高劑量組水腫體積持續(xù)減少，具有顯著差異（P<0.05）。

2.2 尿量和尿液中電解質(zhì)水平

尿量和尿液中電解質(zhì)水平檢測結(jié)果如表1所示。

表1 兔子尿量和尿液中電解質(zhì)水平Tab.1 Comparison of urine volume and electrolyte levels in rabbit urine

由表1可知，與對照組相比，高劑量組的4 h尿量顯著增加（P<0.05）；高劑量組、中劑量組的鈉離子排出量顯著增加（P<0.05）；3個試驗組的銨根陽離子的排出量均顯著增加（P<0.05）。

3 討論

用電刀灼燒會造成兔子皮膚細(xì)胞嚴(yán)重受損，產(chǎn)生水腫，這與運動受傷產(chǎn)生水腫的機(jī)理一致[11]。用排水法測量對比水腫的體積試驗結(jié)果表明，灌胃高、中劑量豬苓菌絲體提取液的兔子，其水腫體積在術(shù)后1周即出現(xiàn)明顯縮小，后續(xù)試驗中也持續(xù)變小，說明豬苓菌絲體中的有效化學(xué)成分起到了很好的作用。機(jī)理可能是豬苓中的多糖、麥角甾醇、甘露聚糖等均具有較強(qiáng)抗菌性和抗氧化性，能夠抑制水腫液中的細(xì)菌滋生，修復(fù)機(jī)體受損細(xì)胞，從而減輕水腫癥狀。

對參與運動的機(jī)體來說，尿液是排出毒素和身體廢棄物的重要途徑，通過尿液來調(diào)節(jié)機(jī)體的酸堿平衡和組織內(nèi)外壓，是減輕水腫癥狀的重要方式[12]。試驗結(jié)果顯示，灌胃了中劑量、高劑量的豬苓菌絲體提取液，可以提高尿液中鈉離子和銨離子的含量。表明豬苓具有加速體內(nèi)鈉離子和銨離子排出的功效，間接降低了血壓，調(diào)節(jié)了組織液的電解質(zhì)平衡，改善了因組織液壓力差而產(chǎn)生的水腫現(xiàn)象。但這種利尿的功效需要灌胃高劑量的豬苓菌絲體提取液。

4 總結(jié)

試驗結(jié)果表明，高劑量的豬苓菌絲體提取液消腫、利尿的效果更好。豬苓菌絲體中的化學(xué)成分，對運動水腫有較好的治療作用，能夠緩解運動造成的水腫，減少運動乳酸及代謝廢物的產(chǎn)生，緩解水腫癥狀。