煙草抗青枯病突變體153-K的抗性遺傳及與農(nóng)藝性狀的關(guān)系

牛文利 巫升鑫 余文 程崖芝 楊興有 余祥文 陳志華 劉勇 丁安明 孫玉合 王衛(wèi)鋒

摘要：煙草青枯病是一種細(xì)菌性病害，嚴(yán)重影響煙葉生產(chǎn)，篩選抗青枯病的煙草種質(zhì)并解析其抗性遺傳效應(yīng)對指導(dǎo)抗病育種具有重要意義。本研究選用感病品種翠碧一號（CB-1）和抗青枯病突變體153-K為親本，構(gòu)建了F2群體，利用“主基因+多基因”混合遺傳模型分析方法，研究其在安徽、福建兩個(gè)病圃環(huán)境下的遺傳效應(yīng)，并對153-K青枯病抗性與農(nóng)藝性狀進(jìn)行相關(guān)分析。結(jié)果表明，153-K在安徽病圃中的最優(yōu)遺傳模型為MX2-EEAD-AD，即2對等顯性主基因+加性-顯性多基因模型;153-K在福建病圃中最優(yōu)遺傳模型為MX2-AD-AD，即2對加性-顯性-上位性主基因+加性-顯性多基因模型。相關(guān)分析結(jié)果表明，在安徽、福建兩個(gè)病圃環(huán)境下，青枯病抗性與株高呈顯著負(fù)相關(guān);而與葉片數(shù)、節(jié)距、莖圍相關(guān)性均不顯著。

關(guān)鍵詞：煙草;青枯病;抗性突變體;遺傳分析;相關(guān)分析

煙草青枯?。═obacco wilt disease）是由青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的土傳細(xì)菌性維管朿病害，該病害易感染、傳播快、毀滅性強(qiáng)。煙草青枯病一般在煙草生長后期發(fā)生，發(fā)病后煙葉產(chǎn)量顯著降低，烤后煙葉青雜煙、光滑煙較多，化學(xué)成分不協(xié)調(diào)，嚴(yán)重影響煙草的品質(zhì)，可用性明顯下降。截至目前，青枯病已成為熱帶、亞熱帶地區(qū)煙田的主要病害。在我國，以云南、福建、廣東四川、貴州等南方煙區(qū)發(fā)病較為嚴(yán)重，某些年份甚至造成毀滅性損失，如：云南文山、臨滄和保山等地。近年來，青枯病正在逐漸向北方煙區(qū)蔓延在山東、河南、遼寧等煙區(qū)均已報(bào)道。

青枯病的防治主要有農(nóng)業(yè)、化學(xué)和生物防治等措施，但均不能有效預(yù)防青枯病的發(fā)生與蔓延，且各種防治措施都存在不足及局限性，比如在生產(chǎn)中大量使用農(nóng)藥對環(huán)境造成嚴(yán)重破壞等。因此明確煙草青枯病抗性的遺傳規(guī)律，選育抗青枯病品種，是目前青枯病防治最基本、最有效、最經(jīng)濟(jì)的防治措施。

選育抗病品種，首先要有良好的抗源并分析其遺傳規(guī)律。目前青枯病抗源來源十分狹窄，國內(nèi)煙草青枯病的抗源主要是從普通煙草品種T448A選育而來，由其育成的DB101及其衍生的Coker139NC95和Coker319是抗青枯病育種的主體親本。

本研究前期通過EMS技術(shù)誘變翠碧一號（CB-1）獲得抗青枯病突變體材料153-K，將該突變體在溫室和田間病圃進(jìn)行青枯病鑒定，153-K均表現(xiàn)為高抗。因此，本研究利用153-K構(gòu)建CB-1x153-K組合，并通過P1、P2、FI和F2多世代聯(lián)合分析，探究153-K抗性基因的遺傳規(guī)律，以期為培育優(yōu)質(zhì)的抗青枯病新品種提供理論基礎(chǔ)，提高育種效率。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料：抗青枯病突變體153-K由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所生物技術(shù)研究中心利用EMS誘變CB-1獲得。以CB-1為父本，突變體153-K為母本，雜交獲得F代，F(xiàn)1自交獲得F2群體。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2020年在安徽省宣城市寒亭鎮(zhèn)和福建省福州市宦溪鎮(zhèn)兩個(gè)病圃進(jìn)行。田間種植行距1.2m，株距0.5m。P，P2，F(xiàn)隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，重復(fù)3次，每重復(fù)10株。安徽F2群體調(diào)查205株，福建F2群體調(diào)查165株。

1.3農(nóng)藝性狀調(diào)查

按照煙草病蟲害分級及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的調(diào)查方法（YCT39-1996），以株為單位調(diào)查發(fā)病情況，并計(jì)算病情指數(shù)。

參照標(biāo)準(zhǔn)YC/T142-2010《煙草農(nóng)藝性狀調(diào)查測量方法》和文獻(xiàn)[11]中所列方法對F2群體進(jìn)行主要農(nóng)藝性狀調(diào)査，調(diào)查性狀為株高、莖圍、節(jié)距、葉片數(shù)。

1.4數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel和SPSS20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計(jì)分析與相關(guān)分析。采用卡方檢驗(yàn)和植物數(shù)量性狀“主基因+多基因”混合遺傳模型分析方法進(jìn)行遺傳分析。

2結(jié)果

2.1153-K抗病性遺傳規(guī)律分析

2.1.1病圃青枯病發(fā)病情況安徽P（CB-1）的病情指數(shù)為8333，P2（153-K）的病情指數(shù)為222;福建P1（CB-1）的病情指數(shù)為84.79，P2（153-K）的病情指數(shù)為31.58。在安徽、福建兩個(gè)病圃環(huán)境下P（CB-1）對青枯病均表現(xiàn)為高感，突變體P2（153-K）對青枯病均表現(xiàn)為高抗。安徽F（CB-1x153-K）病情指數(shù)為90.65。福建F（CB-1×153-K）的病情指數(shù)為90.64，且沒有完全抗青枯病植株的存在，這表明青枯病抗性為隱性遺傳。通過SPSS20.0軟件對F2代各病級株數(shù)進(jìn)行正態(tài)分布分析（卡方檢驗(yàn)），發(fā)現(xiàn)直方圖中頻率分布有明顯的波峰，且偏度約等于0，說明F2代各病級株數(shù)呈正態(tài)分布;Q-Q圖檢驗(yàn)看出各病級的頻數(shù)基本分布在直線附近，進(jìn)一步說明F2代各病級株數(shù)服從正態(tài)分布（圖1、2）。該結(jié)果表明兩個(gè)環(huán)境下的F2代均存在一定性狀分離，可以進(jìn)行遺傳規(guī)律的分析。

2.1.2主基因+多基因混合模型遺傳規(guī)律分析利用P1、P2、F1和F2四個(gè)世代，對安徽、福建兩個(gè)環(huán)境下的煙草抗青枯病突變體153-K的抗青枯病數(shù)量性狀進(jìn)行“主基因+多基因”混合遺傳分析，得到兩個(gè)環(huán)境下的24種模型的AIC值、極大似然值（表1），根據(jù)AIC值最小原則選擇最優(yōu)模型。在安徽CB-1153-K組合中，AIC值較低的有MX2-EEAD-AD、MX2-A-AD、MX2-AD-AD和2MG-EEAD;在福建CB-1x153-K組合中，AIC值較小的模型有MX2-ADI-AD和MX2-AD-ADI，將以上模型作為兩個(gè)環(huán)境下的備選模型。

利用、2、る、n、Dm對安徽、福建兩個(gè)環(huán)境下的備選模型進(jìn)行適合性檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)量達(dá)到顯著水平個(gè)數(shù)最少及AIC值最小的模型為最優(yōu)模型。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示（表2），安徽CB-1×153-K組合中，MX2-EEAD-AD、MX2-A-AD、MX2-AD-AD和2MG-EAD分別有5、7、7、7個(gè)統(tǒng)計(jì)量與該模型的差異達(dá)到顯著水平（p《0.05），根據(jù)AIC值最小且統(tǒng)計(jì)量差異達(dá)到顯著水平最少原則，確定MX2-EEAD-AD模型為安徽CB-1×153-K組合的最優(yōu)遺傳模型，即2對等顯性主基因模型;同理，在福建病圃CB-1×153-K組合中（表3），MX2-ADI-AD和MX2-ADI-ADI分別有8、8個(gè)統(tǒng)計(jì)量與該模型的差異達(dá)到顯著水平（p《0.05），根據(jù)AIC值最小原則確定MX2-ADI-AD為福建CB-1×153-K組合的最優(yōu)遺傳模型，即2對加性-顯性-上位性主基因模型。

2.13遺傳參數(shù)估計(jì)對安徽、福建兩個(gè)環(huán)境下最適模型的遺傳參數(shù)進(jìn)行估計(jì)。結(jié)果表明（表4），在安徽，群體平均數(shù)（m）為3.9687，第1對基因的加性效應(yīng)（da）為1.6121，顯性效應(yīng)為0。第2對基因的加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)均為0，說明兩對基因只存在加性效應(yīng)。此外，ja=ja==0，說明兩對主基因不存在相互作用。多基因的加性效應(yīng)（の）為0.409，顯性效應(yīng)（）為1.1795，以顯性效應(yīng)為主主基因的遺傳率為71.81%。

在福建，CB-1153-K中（表4），群體平均數(shù)m）為3.4263，第1對基因的加性效應(yīng)（da）為2.4959，顯性效應(yīng)（ha）為-15203，則d》ba且.顯性度（d）小于1，說明第1對基因主要表現(xiàn)為加性作用。在第2對基因中，加性效應(yīng)值（b）為0.4969，顯性效應(yīng)值（h）為-1.6512，則第2對基因主要表現(xiàn)為顯性效應(yīng)。對兩對基因相互作用的參數(shù)值進(jìn)行分析，加性×加性互作效應(yīng)（）為0.5268，加性顯性互作效應(yīng)（ia）為1.6213，顯性x加性互作效應(yīng)（ia）為2.4962，顯性顯性互作效應(yīng)（）為1.6746，上位性效應(yīng)均為正向，其中ia》トia》i，表明上位性效應(yīng)中以顯性ⅹ加性互作和顯性ⅹ顯性互作效應(yīng)較大，說明其促進(jìn)了抗病性提高。主基因的遺傳率為94.74%，表明抗性主要受主基因作用，可在后代中穩(wěn)定遺傳。

2.2153-K抗病性與農(nóng)藝性狀的相關(guān)性分析

2.2.1農(nóng)藝性狀對2020年安徽和福建田間農(nóng)藝性狀進(jìn)行調(diào)查分析。從圖3可以看出，CB-1株高顯著高于153-K（p0.05）（圖3A），葉片數(shù)與153-K接近，不存在顯著性差異（圖3B）（p》0.05），莖圍顯著粗于153-K（圖3C）（《0.05）;CB-1節(jié)距在安徽顯著高于153-K，而兩個(gè)品種在福建沒有顯著性差異（圖3D）（p》0.05）。因此，突變體153-K與CB-1相比，153-K的單株表型為整體較矮小，而葉片數(shù)無顯著性變化。

2.2.2F2群體的病情級別與農(nóng)藝性狀的相關(guān)分析對F2的病情級別（病級）與田間主要農(nóng)藝性狀進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果表明（表5），在安徽，病級與株高的相關(guān)系數(shù)是-0.475（p《0.01），為極顯著負(fù)相關(guān)，與葉片數(shù)、節(jié)距、莖圍為不顯著負(fù)相關(guān)。在福建，病級與株高的相關(guān)系數(shù)是-0.221（p《0.05），為顯著負(fù)相關(guān)，病級與葉片數(shù)、節(jié)距為不顯著負(fù)相關(guān)，與莖圍為不顯著正相關(guān)。

3討論

抗源材料是煙草抗青病育種的基礎(chǔ)，T448A是國內(nèi)外少數(shù)抗青枯病的種質(zhì)資源之一。1945年美國首個(gè)育成抗青枯病品種Oxford26，后來相繼培育出了DB101、Coker139。用Coker139育成的NC95、Coker319和G-28是20世紀(jì)70年代美國主要抗青枯病品種和主體親本。而我國青病抗病育種研究起步較晚，開始于20世紀(jì)90年代。我國新審定的抗青枯病新品種有云煙、云煙2031、云煙87、巖煙97等。目前國內(nèi)大部分青枯病抗性來源難以追蹤，抗性來源明確的親本也不屬于常見的抗源。

改進(jìn)傳統(tǒng)的育種手段和方法，對快速培育煙草抗青枯病優(yōu)良品種非常重要。EMS誘變技術(shù)是人為獲得某些可遺傳新材料的常用方法。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所采用EMS處理“翠碧一號”種子，經(jīng)過M2、M3代抗病性鑒定，獲得“翠碧一號”抗青枯病突變體22個(gè)。突變體153-K就是通過EMS誘變技術(shù)獲得的高抗青枯病的新抗源，為煙草抗青枯病育種及抗病機(jī)理的研究提供了材料。

煙草青枯病抗性是受遺傳和環(huán)境兩個(gè)相互作用因素的影響。前人研究表明，不同煙草種質(zhì)資源對青枯病的抗性遺傳存在差異。楊友才等對煙草抗性資源448A的抗性遺傳機(jī)理進(jìn)行研究，結(jié)果表明其抗性受顯性單基因控制。QIAN等叫研究認(rèn)為，巖煙97的青枯病抗性在田間表現(xiàn)為主基因控制。耿銳梅等對巖煙97的青枯病抗性進(jìn)行分析，結(jié)果表明其抗性受2對加性、顯性、上位性主基因以及加性、顯性、上位性多基因控制。鄒文莉等對烤煙品種翠碧一號通過EMS誘變而來的突變體117-K、486-K的抗性遺傳規(guī)律進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其抗性遺傳效應(yīng)存在一些差異，突變體117-K的抗性受2對主基因控制，具有加性效應(yīng)。突變體486-K的抗性受2對主基因控制，具有加性-顯性-上位性效應(yīng)。

本研究對安徽、福建環(huán)境中突變體153-KxCB-1組合P1、P2、F1和F2四個(gè)世代采用“主基因+多基因”混合遺傳模型進(jìn)行聯(lián)合分析，在安徽，153-K表現(xiàn)為2對主基因控制，具有等顯性效應(yīng)。在福建，受2對加性-顯性上位主基因控制，與鄒文莉等24對突變體486-K進(jìn)行的青枯病抗性遺傳規(guī)律研究結(jié)果一致。本研究在安徽、福建兩個(gè)環(huán)境下，其抗性遺傳效應(yīng)存在一些差異，可能是因?yàn)椋海?）不同環(huán)境下病情的分化差異很大。青枯病多發(fā)生在高溫高濕條件下，土壤、氣候等生態(tài)條件也會影響青枯病的發(fā)生。因此，同一品種在同一年份不同試驗(yàn)點(diǎn)的發(fā)病情況可能也有差異。（2）煙草青枯菌菌系分化比較復(fù)雜，因寄主范圍、地理分布、致病性以及生理特性的多樣性和復(fù)雜性被公認(rèn)為多變的復(fù)合種青枯菌還具有種下遺傳多樣性。福建、安徽兩個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的青枯菌都是青枯菌生理小種1號，以演化型進(jìn)行劃分時(shí)都是演化型1，但其演化型下具有序列變種差異性。福建省擁有13、14、15、17、34和44六個(gè)序列變種，安徽青枯菌為序列變種15，安徽、福建兩個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)青枯菌在序列變種上具有差異性。不同試驗(yàn)點(diǎn)的青枯菌在致病性和某些性狀上可能也存在差異。這可能是153-K遺傳模型不同的原因。總之，雖然兩個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)遺傳模型略有不同，但153-K青枯病抗性都是受兩對主基因控制，且均具有顯性效應(yīng)。

4結(jié)論

本研究采用卡方檢驗(yàn)和“主基因+多基因”混合遺傳模型聯(lián)合分析了煙草抗青枯病突變體153-K在安徽、福建兩地試驗(yàn)點(diǎn)的遺傳規(guī)律，分別為MX2-EEAD-AD和MX2-ADI-AD模型。在安徽試驗(yàn)點(diǎn)，突變體153-K的抗性受2對主基因控制，具有等顯性效應(yīng)。在福建試驗(yàn)點(diǎn)中，突變體153-K的抗性受2對主基因控制，具有加性-顯性-上位性效應(yīng)。對安徽和福建兩個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)CB-1×153-KF2群體的病級與農(nóng)藝性狀進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明，F(xiàn)2病級與株高顯著負(fù)相關(guān)。葉片數(shù)、節(jié)距、莖圍對青枯病發(fā)病程度影響不顯著。

參考文獻(xiàn)

[1]陳勇，金晨鐘煙草青枯病的發(fā)生與防治現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2009（10）：92-93

[2]朱賢朝，王彥亭，王智發(fā).中國煙草病害M北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002：152-162

[3]陳瑞泰，朱賢朝，王智發(fā)，等.全國16個(gè)主產(chǎn)煙?。▍^(qū)）煙草侵染性病害調(diào)查報(bào)告.中國煙草科學(xué)，1997（4）：1-7

[4]劉勇，秦西云，王敏，等.云南省煙草青枯病危害調(diào)査與病原菌分離[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2007，23（4）：311-314

[5]劉勇，范江，李永平.煙草抗青枯病育種研究進(jìn)展.中國煙草學(xué)報(bào)，2012，18（6）：93-99

[6]何明興，沈亮，邱恒良，等，煙草青枯病的發(fā)生及防治.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2019（11）：11115

[7] LIY， FENG J， LIU H L， et al. Genetic diversity and pathogenicity of Ralstonia solanacearum causing tobacco bacterial wilt in China[J]Plant Disease，2016，100（7）：1288-1296

[8] MA L， ZHANG H Y， ZHOU X K， et al. Biological control tobacco bacterial wilt and black shank and root colonization by bio-organi fertilizer containing bacterium Pseudomonas aeruginosa NXHG29 Applied Soil Ecology， 2018， 129（5）： 136-134

[9] SMITH T E， CLAYTON E E Inheritance of resistance to bacterial wilt in tobacco [J]. Journal of Agricultural Research， 1948， 760）

[10]王元英，周健中美主要煙草品種親源分析與煙草育種.中國煙草學(xué)報(bào)，1995，2（3）：11-22

[11]劉國順.煙草栽培學(xué)D[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2003

[12]王建康，蓋鎰.利用雜種F2世代鑒定數(shù)量性狀主基因-多基因混合遺傳模型并估計(jì)其遺傳效應(yīng)[J].遺傳學(xué)報(bào)，1997（5）：43240.

[13]章元明，蓋鎰.數(shù)量性狀分離分析中分布參數(shù)估計(jì)的ECM算法作物學(xué)報(bào)，2000（6）：6970

[14]章元明，蓋鎰，張孟臣.利用PIFIP2和F2或F（2：3）世代聯(lián)合的數(shù)量性狀分離分析.西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，200022（1）

[15]李永平，盧秀萍，王穎寬烤煙新品種云煙202的選育及特征特性.中國煙草科學(xué)，2005（4）：16-18.

[16]焦芳嬋，肖炳光，李永平，等烤煙新品種“云煙203”的選育及特征特性.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010，23（3）：625-628

[17]李永平，王穎寬，馬文廣，等.烤煙新品種云煙87的選育及特征特性中國煙草科學(xué)，2001（4）：38-42

[18]劉貫山，孫玉合.煙草突變體[M]上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2016：345-353

[19]劉貫山.煙草突變體創(chuàng)制、篩選與鑒.中國煙草科學(xué)，201334（2）：13-14.

[20]王新.煙草抗青枯病突變體的鑒定與轉(zhuǎn)錄組分析[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2018.

[21]楊友才，周清明，朱列書.煙草青枯病抗性基因的遺傳分析及RAPD標(biāo)記.中國煙草學(xué)報(bào)，2006（2）：38-42.

[22] QIAN Y L， WANG X S， WANG D Z. The detection of QTLS controlling bacterial wilt resistance in tobacco（Ntabacum L）[J]Euphytica，2013（192）：259-266

[23]耿銳梅，程立銳，劉旦，等煙草青枯病抗性遺傳效應(yīng)分析.中國煙草科學(xué)，2019，40（4）：7-13

[24]鄒文莉，牛文利，楊華應(yīng)，等.煙草青枯病抗性突變體486-K和117-K的遺傳分析中國煙草科學(xué)，2020，40（2）：1-7