UPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定黃芪-甘草藥對(duì)8個(gè)有效成分

王晶萍，董微微，赫志強(qiáng)，董林爭(zhēng)，趙麗珠*

(1. 哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，哈爾濱 150076； 2.鶴崗市檢驗(yàn)檢測(cè)中心，黑龍江 鶴崗 154100； 3.譜尼測(cè)試有限公司，哈爾濱 150028)

黃芪為豆科植物蒙古黃芪[Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge. var.mongholicus(Bge.)Hsiao]或膜莢黃芪[A.membranaceus(Fisch. ) Bge. ]的干燥根，具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、生津養(yǎng)血、固表止汗、托毒生肌等功效，是我國(guó)最具代表的補(bǔ)氣藥物之一[1].黃芪配伍甘草(GlycyrrhizaeRadix，GR)，二者相須為用，可以大大提高二者間的協(xié)同作用[2].黃芪-甘草藥對(duì)始載于《太平惠民和劑局方》，能補(bǔ)肺腎二氣、調(diào)和脾胃表里臟腑、化津布液以滋益腎水、又能外固衛(wèi)外而強(qiáng)腠理[3].現(xiàn)代藥理研究亦證明：黃芪-甘草可治療諸虛不足[4]、脾肺氣虛[5]、慢性乙型肝炎肝硬化[6]，酒精性肝纖維化及糖尿病[7]等病.

黃芪中黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷，甘草中甘草酸、甘草苷為主要的藥理活性成分[8-9]，同時(shí)上述4種成分也是藥典中收錄的黃芪或甘草藥材質(zhì)量控制指標(biāo)成分.黃芪甲苷具有抗炎、降壓、抗癌、治療代謝性疾病等作用[10-12]，是黃芪-甘草藥對(duì)中最重要的活性成分之一.毛蕊異黃酮葡萄糖苷具有抗腫瘤、抗氧化活性、抗炎作用、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，還可通過(guò)抑制Rho/ROCK通路、上調(diào)AKT通路，改善細(xì)胞凋亡和抑制炎癥，從而保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞[13-14].甘草酸具有抗炎、抗?jié)?、抗過(guò)敏、抗氧化、抗疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗癌、保肝和穩(wěn)定細(xì)胞膜等作用[15-17]；甘草苷具有抗抑郁、神經(jīng)保護(hù)、對(duì)肝臟毒性的保護(hù)、對(duì)心臟系統(tǒng)的作用[18-19].

與大量的藥理活性相比，對(duì)黃芪-甘草藥對(duì)中主要活性成分的研究未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道.丁淑芹等[20]灌胃給予昆明小鼠黃芪-甘草藥對(duì)水提液，發(fā)現(xiàn)其對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的損傷具有保護(hù)作用，并可顯著抑制增加小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率.此外，王迪等[21]的黃芪-甘草藥對(duì)、黃芪、甘草均可提高小鼠細(xì)胞免疫功能，且黃芪-甘草藥對(duì)組的活性強(qiáng)于黃芪組和甘草組.另有研究發(fā)現(xiàn)，黃芪-甘草藥對(duì)可使大鼠膽汁淤積性肝硬化程度顯著減輕[7].基于此，本研究采用UPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定黃芪-甘草藥對(duì)中8種主要成分含量，以期為中藥黃芪-甘草藥對(duì)的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù).

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters ACQUITY UPLC I-Class系統(tǒng)、Xevo TQS系統(tǒng)(美國(guó)Waters公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó)IKA公司)；AG-245電子分析天平 (瑞士Mettler-Toledo公司)；FW177中草藥粉碎機(jī)(天津泰斯特儀器有限公司)；標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩(60目，孔徑0.30 mm，紹興上虞華豐五金儀器有限公司)；乙腈和甲醇(色譜純，美國(guó)Fisher公司)，乙酸(色譜純，德國(guó)Merck公司).

1.2 材料

對(duì)照品毛蕊異黃酮葡萄糖苷(批號(hào)：U0520010)、甘草苷(批號(hào)：12400010)、芒柄花苷(批號(hào)：G2990010)、甘草素(批號(hào)：T4890010)、毛蕊異黃酮(批號(hào)：34410010)、黃芪甲苷(批號(hào)：T0920025)、芒柄花素(批號(hào)：Q4150010)、甘草酸(批號(hào)：3462)購(gòu)于上海安譜有限公司.所有化合物經(jīng)HPLC-DAD分析，純度均大于98%.黃芪購(gòu)于內(nèi)蒙古、貴州、河南、山西、甘肅、黑龍江.甘草購(gòu)于新疆、內(nèi)蒙古、甘肅、山西、陜西、黑龍江.樣品標(biāo)本保留在哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室.經(jīng)哈爾濱商業(yè)大學(xué)大學(xué)曲中原教授鑒定分別為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge. var. mongholicus(Bge.)Hsiao的干燥根、豆科甘草屬植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根及根莖.

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜及質(zhì)譜條件

色譜采用Waters ACQUITYTMUPLC系統(tǒng)檢測(cè).色譜柱：Acquity UPLC BEH C18(50 mm ×2.1 mm, 1.7 μm )柱; 柱溫：30 ℃; 流動(dòng)相：體積分?jǐn)?shù)0. 1%乙酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫; 洗脫程序：0～1.0 min 20% B，1.0～7.0 min 20%～60% B，7.0～9.0 min 60%～90% B，9.0～9.1 min 90%～20% B，9.1～10.0 min 20% B; 流速：0. 3 mL·min-1；自動(dòng)進(jìn)樣；樣品室溫度：20℃；進(jìn)樣量：2 μL.

質(zhì)譜條件: 電噴霧離子源(ESI源)，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)檢測(cè)，源溫度和脫溶劑氣溫度分別為150 ℃和500 ℃，脫溶劑氣為氮?dú)猓魉贋? 000 L·h-1，碰撞氣為氬氣，毛細(xì)管電壓為3.0 kV.8個(gè)分析物的定量離子、定性離子、保留時(shí)間、錐孔電壓等信息見(jiàn)表1.

表1 8種分析物的定量離子、定性離子、保留時(shí)間、錐孔電壓和碰撞能量

2.2 供試品溶液的制備

黃芪、甘草藥材干燥24 h，打粉，過(guò)60目篩，按6∶1比例分別稱取干燥的黃芪、甘草粉末共計(jì)10 g，置500 mL圓底燒瓶中，加水200 mL，浸泡12 h后，加熱回流提取1 h，提取3次，3 500 r/min離心10 min，吸取上清液，合并上清液并旋干.精密稱取黃芪-甘草提取物10 mg，用適量10%甲醇-水溶解，經(jīng)0.22 μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液[22].

2.3 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、芒柄花苷、甘草素、毛蕊異黃酮、黃芪甲苷、芒柄花素、甘草酸適量置50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻.配成質(zhì)量濃度分別為1.0 mg·mL-1的儲(chǔ)備液，置于4 ℃冰箱中儲(chǔ)存.

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性考察

分別取對(duì)照品、供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行分析，各化合物之間無(wú)干擾，方法專屬性良好.

2.4.2 線性關(guān)系考察

精密吸取毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、芒柄花苷、甘草素、毛蕊異黃酮、黃芪甲苷、芒柄花素、甘草酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，配制成相當(dāng)于毛蕊異黃酮葡萄糖苷質(zhì)量濃度為0.01、0.02、0.05、0.10和0.20 μg·mL-1，甘草苷質(zhì)量濃度為0.01、0.02、0.05、0.10和0.20 μg·mL-1，芒柄花苷質(zhì)量濃度為0.02、0.04、0.08、0.12和0.20 μg·mL-1，甘草素質(zhì)量濃度為0.01、0.02、0.05、0.10和0.20 μg·mL-1，毛蕊異黃酮質(zhì)量濃度為0.02、0.04、0.08、0.12和0.20 μg·mL-1，黃芪甲苷質(zhì)量濃度為0.06、0.12、0.18、0.24和0.30 μg·mL-1，芒柄花素質(zhì)量濃度為0.01、0.02、0.05、0.10和0.20 μg·mL-1，甘草酸質(zhì)量濃度為1.00、2.00、5.00、10.0和20.0 μg·mL-1，按色譜條件進(jìn)樣分析.以對(duì)照品峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線.各指標(biāo)成分在測(cè)定濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，結(jié)果見(jiàn)表2.以特征離子對(duì)色譜峰的信噪比(S/N)≥3 確定檢出限(LOD)，S/N≥10 確定定量限(LOQ)，結(jié)果見(jiàn)表2.

表2 8種分析物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限、定量限

2.4.3 精密度

精密吸取同一份對(duì)照品溶液2 μL，按“2.1”項(xiàng)色譜條件連續(xù)測(cè)定6次，結(jié)果顯示：毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、芒柄花苷、甘草素、毛蕊異黃酮、黃芪甲苷、芒柄花素、甘草酸RSD在0.08%～3.56%之間，表明儀器精密度良好.

2.4.4 重復(fù)性

以黃芪-甘草藥對(duì)提取物進(jìn)行重復(fù)性考察，按照上述供試品制備方法，平行制備黃芪-甘草樣品6份，進(jìn)樣2μL，依法測(cè)定，記錄峰面積，結(jié)果顯示：毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、芒柄花苷、甘草素、毛蕊異黃酮、黃芪甲苷、芒柄花素、甘草酸RSD分別為0.92%、1.83%、1.69%、2.37%、1.31%、0.82%、2.49%、2.48%，表明方法重復(fù)性良好.

2.4.5 穩(wěn)定性

取黃芪-甘草藥對(duì)提取物供試品溶液，分別于室溫下0、4、8、12、24、48 h，進(jìn)樣2 μL，依法測(cè)定，記錄峰面積，結(jié)果顯示：毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、芒柄花苷、甘草素、毛蕊異黃酮、黃芪甲苷、芒柄花素、甘草酸RSD在0.92%～2.49%之間，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定.

2.4.6 加樣回收率

取批號(hào)為100602的黃芪-甘草藥對(duì)樣品6份，每份約0.10 g，精密加入8種對(duì)照品，按照上述供試品制備方法，平行制備黃芪-甘草樣品6份，進(jìn)樣2 μL，依法測(cè)定，結(jié)果顯示：毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、芒柄花苷、甘草素、毛蕊異黃酮、黃芪甲苷、芒柄花素、甘草酸平均加樣回收率分別為99.59%、98.52%、98.10%、97.83%、96.63%、98.60%、98.44%、98.15%.

2.5 樣品測(cè)定

精密稱取黃芪-甘草藥對(duì)，按“2.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，每個(gè)樣本平行3份，按“2.1”項(xiàng)下色條件進(jìn)行測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖1.

圖1 黃芪-甘草中8種分析物的UPLC-MS/MS色譜圖

2.6 結(jié) 果

6批黃芪-甘草藥對(duì)藥材，按“2.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，精密吸取2 μL進(jìn)樣 UPLC-MS/MS進(jìn)行分析，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3.

表3 黃芪-甘草藥對(duì)中含8種成分的量(mg·g-1)

3 討 論

本文考察了不同流動(dòng)相系統(tǒng)，包括乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%乙酸水溶液、乙腈-10 mmol/mL乙酸銨水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液，結(jié)果表明，乙腈-0.1%乙酸水系統(tǒng)洗脫時(shí)，待測(cè)分析物靈敏度較高、色譜峰峰形、分離度、基線噪音均能達(dá)到較好的洗脫效果，故本實(shí)驗(yàn)最終采用乙腈-0.1%乙酸水溶液作為流動(dòng)相系統(tǒng).8種待測(cè)組分分別以質(zhì)量濃度0.50mg/L和2.0 μL/min的流速直接用注射泵進(jìn)行優(yōu)化，標(biāo)準(zhǔn)溶液通過(guò)流動(dòng)相注入離子源中，在正離子或負(fù)離子模式下得到準(zhǔn)分子離子峰，再對(duì)準(zhǔn)分子離子峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析(子離子掃描)，得到碎片離子信息，對(duì)錐孔電壓、碰撞能量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，使每種組分的準(zhǔn)分子離子產(chǎn)生的特征碎片離子強(qiáng)度達(dá)到最大；標(biāo)準(zhǔn)溶液由 UPLC進(jìn)樣，再對(duì)離子源溫度、脫溶劑氣溫度、脫溶劑氣流量等進(jìn)行優(yōu)化.選擇兩對(duì)離子對(duì)，其中干擾小、信噪比大的離子對(duì)作為定量離子對(duì).設(shè)定合適的峰駐留時(shí)間(dwell time)確保色譜峰的采樣點(diǎn)數(shù)在12～20點(diǎn)，從而得到較好的定量重復(fù)性，優(yōu)化得到的質(zhì)譜參數(shù).

黃酮和皂苷類化合物是黃芪-甘草藥對(duì)的主要活性成分，因皂苷類化合物無(wú)紫外吸收或有微弱的紫外吸收，故用DAD檢測(cè)器無(wú)法同時(shí)測(cè)定黃酮和皂苷類化合物.所以本文首次建立UPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定黃芪-甘草藥對(duì)中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、芒柄花苷、甘草素、毛蕊異黃酮、黃芪甲苷、芒柄花素、甘草酸8種有效成分含量的方法，多指標(biāo)控制黃芪和甘草藥材提供參考.