染色體分散儀在外周血染色體標(biāo)本制備中的應(yīng)用

明盛金 馬洪熹 黃瀅 鐘錦萍 吳文躍 黃瑤 陳學(xué)杰

【摘要】 目的 探討Thermotron Model CDS-5染色體分散儀在外周血染色體制備中的應(yīng)用。

方法 使用染色體分散儀控制染色體滴片時(shí)的環(huán)境溫度及濕度，在不同溫度/濕度組合下制備染色體并對(duì)制備成功率、分散效果進(jìn)行分析。同時(shí)與傳統(tǒng)滴片法制備染色體的成功率、分散效果進(jìn)行比較。

結(jié)果 在一定溫度和相對(duì)濕度范圍內(nèi)，升高溫度和濕度可以提高染色體的制備成功率和分散效果。超過溫度和濕度閾值時(shí)，染色體制備成功率、分散效果反而下降。將Thermotron Model CDS-5染色體分散儀溫度設(shè)為25℃，濕度設(shè)為55%時(shí)，染色體分散效果最好。染色體制備成功率、分散效果優(yōu)于傳統(tǒng)滴片法（P<0.001）。

結(jié)論 Thermotron Model CDS-5染色體分散儀在最佳溫度/濕度組合下可制備出優(yōu)質(zhì)的染色體，提高染色體核型分析的準(zhǔn)確性，值得向各實(shí)驗(yàn)室推廣。

【關(guān)鍵詞】 染色體分散儀; ?染色體; ?制備成功率;分散效果

中圖分類號(hào)：R440 ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2021.12.008

【Abstract】 Objective To investigate the application of Thermotron Model CDS-5 chromosome disperser in the preparation of chromosomes in peripheral blood.

Methods Chromosome dispersing apparatus was used to control the ambient temperature and humidity of chromosome drops. Chromosomes were prepared under different temperature/humidity combinations， and the success rate of preparation and dispersion effect were analyzed.At the same time， the success rate and dispersion effect of chromosome preparation were compared with that with traditional dropping method.

Results In a certain range of temperature and relative humidity， increasing temperature and humidity could improve the success rate of chromosome preparation and dispersion quality.When the temperature and humidity threshold were exceeded， the success rate of chromosome preparation and the dispersion quality decreased.When the temperature of Thermotron Model CDS-5 chromosome disperser was set to 25℃ and humidity was set to 55%， the chromosome dispersion effect was the best. The success rate of chromosome preparation and the dispersion effect were better than than those of the traditional dropping method.

Conclusion Thermotron Model CDS-5 chromosome disperser can produce high quality chromosomes and improve the accuracy of chromosome karyotype analysis under the optimal combination of temperature and humidity.It is worth popularizing to various laboratories.

【Key words】 chromosome disperser; chromosome; preparation success rate; dispersion effect

隨著高通量測(cè)序技術(shù)在染色體病檢測(cè)中的應(yīng)用與推廣，檢測(cè)范圍進(jìn)一步擴(kuò)大，檢測(cè)成本大幅下降，在臨床應(yīng)用中被越來越多的醫(yī)務(wù)工作者和患者所接受[1]。但是，染色體核型分析依然是染色體病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[2]。在染色體核型分析工作中，高質(zhì)量的染色體是核型分析準(zhǔn)確性的重要保證。理想的染色體核型應(yīng)該是分散均勻、很少或無相互交疊、分辨率高、帶紋清晰的。由于染色體的制備過程復(fù)雜，標(biāo)本制備的質(zhì)量與多種因素有關(guān)，包括培養(yǎng)基的質(zhì)量、低滲過程中吹打的力度、低滲時(shí)間、固定液中甲醇和冰醋酸的比例、滴片的方式、滴片環(huán)境中的溫濕度、氣流的控制等等[3～6]。早在1996年SPURBECK等[7]就提出了染色體分散動(dòng)力學(xué)這一概念，為染色體的分散問題與研究提供了理論基礎(chǔ)。在此基礎(chǔ)上有學(xué)者[8]提出滴片環(huán)境的溫度和濕度是最重要的影響因素。為此，基于染色體分散動(dòng)力學(xué)原理設(shè)計(jì)出的染色體分散儀，通過儀器控制滴片環(huán)境的溫度、濕度，進(jìn)而控制載玻片表面固定液的揮發(fā)速度，影響染色體的分散效果。本實(shí)驗(yàn)室利用新購買的Thermotron Model CDS-5染色體分散儀進(jìn)行滴片環(huán)境溫度、濕度的控制，進(jìn)行適當(dāng)?shù)募夹g(shù)改良，獲得良好的制片效果，現(xiàn)作如下介紹。

1 材料與方法

1.1 材料

410份血液標(biāo)本來自梧州市工人醫(yī)院生殖中心門診就診的患者的外周靜脈血。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備與耗材

Model CDS-5分散儀購自美國Thermotron， Axio Imager Zeiss & Meta systems全自動(dòng)掃描染色體圖像分析系統(tǒng)購自德國美達(dá)思軟件和硬件技術(shù)有限公司，CO2培養(yǎng)箱購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司，滴片用免洗載玻片購自上海樂辰生物技術(shù)有限公司，淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基、秋水仙素、吉姆薩染液購自廣州達(dá)暉生物技術(shù)有限公司，氯化鉀購自廣東西隴科學(xué)股份有限公司，甲醇，冰醋酸購自四川西隴科學(xué)有限公司，胰蛋白酶購自GIBCO。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞懸液的制備

無菌采集靜脈血0.4 mL并接種于外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h，加入秋水仙素繼續(xù)培養(yǎng)0.5 h。收獲細(xì)胞，經(jīng)0.075 mol/L氯化鉀低滲液低滲處理、甲醇與冰乙酸之比為3∶1配成的固定液預(yù)固定1次、正式固定2次后制成細(xì)胞懸液放置4℃冰箱過夜，第二天再固定一次后根據(jù)收獲的細(xì)胞沉淀量配制成一定濃度的細(xì)胞懸液滴片。

1.3.2 滴片

Thermotron Model CDS-5分散儀溫度范圍為20～40℃，濕度范圍為25%～75%。設(shè)置20℃、25℃、30℃3個(gè)溫度梯度，40%、45%、50%、55%、60%、65% 6個(gè)濕度梯度。根據(jù)不同的溫度/濕度組合，在分散儀內(nèi)放入干的載玻片，于載玻片正上方1 cm向每張載玻片滴2滴細(xì)胞懸液，每個(gè)溫度/濕度組合滴片2張，分散儀內(nèi)自然晾干。實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滴片法參考醫(yī)學(xué)細(xì)胞遺傳學(xué)國家培訓(xùn)中心教材[9]。

1.3.3 消化顯帶及觀察

胰酶消化，吉姆薩染色。使用Axio Imager Zeiss & Meta systems全自動(dòng)掃描染色體圖像分析系統(tǒng)上機(jī)掃描，每個(gè)溫度/濕度組合掃描2張玻片，每張玻片計(jì)算機(jī)系統(tǒng)自動(dòng)選取排名前60的60幅核型圖，每個(gè)組合選取120幅核型圖供分析。對(duì)不同溫度/濕度組合，染色體制備成功率和染色體重疊交叉少于3條的分裂象個(gè)數(shù)占可供分析分裂象百分比進(jìn)行分析。取10份細(xì)胞懸液標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)研究，最終結(jié)果取平均值，確定最佳溫度/濕度組合。

1.3.4 染色體制備成功評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

日常工作中常用的評(píng)價(jià)染色體質(zhì)量的指標(biāo)包括有絲分裂指數(shù)、異常核型檢出率、染色體制備成功率;每張片子上至少有5個(gè)可供分析的細(xì)胞分裂象即可認(rèn)為成功，可供分析的分裂象占分裂象總數(shù)的百分比即為染色體制備成功率;有絲分裂指數(shù)、異常核型檢出率等指標(biāo)均以“可供分析的分裂象”為基礎(chǔ)進(jìn)行評(píng)定。因此本研究取較直觀獲取的染色體制備成功率作為標(biāo)準(zhǔn)[10]。隨機(jī)選取200例應(yīng)用染色體分散儀（最佳溫度/濕度）改良滴片法滴片的日常標(biāo)本作為實(shí)驗(yàn)組，200例傳統(tǒng)滴片法滴片的日常標(biāo)本作為對(duì)照組，每例選取一張玻片，取排名前60的核型圖，每組12 000個(gè)核型圖進(jìn)行染色體制備成功率、染色體重疊交叉少于3條的分裂象個(gè)數(shù)占可供分析分裂象百分比統(tǒng)計(jì)比較。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)分析，率的比較采用卡方檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié) ?果

2.1 不同溫度/濕度組合下，染色體制備成功率

每個(gè)組合分別統(tǒng)計(jì)120個(gè)分裂象，染色體分裂象呈類圓形均勻分布，染色體交叉少，核型分辨率高，條帶清晰，達(dá)320條帶水平以上[11]。在一定的溫度和濕度閾值范圍內(nèi)，染色體制備成功率隨著溫度、濕度的上升而增高。相對(duì)于溫度而言，濕度對(duì)染色體制備成功率的影響更大。但當(dāng)超過一定的溫濕度閾值時(shí)，染色體制備成功率呈下降趨勢(shì)，鏡下可見染色體條帶縮短，形態(tài)模糊，交叉重疊。本實(shí)驗(yàn)研究數(shù)據(jù)表明，外周血標(biāo)本染色體滴片時(shí)，分散儀的溫度設(shè)置為25℃，濕度為55%時(shí)，染色體制備成功率最高，達(dá)到74.17%。制備成功率越高，則說明制備染色體的條件越好。見圖1。

2.2 不同溫度/濕度組合下染色體重疊交叉少于3條的分裂象個(gè)數(shù)占可供分析分裂象百分比

每個(gè)組合分別統(tǒng)計(jì)120個(gè)分裂象，每個(gè)分裂象中染色體重疊交叉<3條，說明分散好。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)再次證明，溫度和濕度是影響染色體分散效果的重要因素，在一定濕度閾值范圍內(nèi)，染色體重疊交叉少于3條的分裂象個(gè)數(shù)占可供分析分裂象百分比隨著濕度的升高而升高，在55%濕度附近達(dá)到最大值，超過55%濕度該百分比呈下降趨勢(shì)。說明在此濕度環(huán)境下分散效果最佳。在濕度45%～55%范圍內(nèi)，25℃比20℃、30℃擁有更高可供分析分裂象百分比。在溫度25℃、55%濕度環(huán)境下，染色體重疊交叉少于3條的分裂象個(gè)數(shù)占可供分析分裂象百分比達(dá)97.75%。此百分比越高，說明分散得越好。見圖2。

2.3 基于分散儀的改良滴片法與常規(guī)滴片法的比較

顯微鏡下觀察，基于分散儀的改良滴片法每張玻片上的核型分散均一，重復(fù)性好，獲得的分裂象多呈圓形或橢圓形分散，染色體交叉少（圖3）。而常規(guī)滴片法獲得的分裂象與前者相比，染色體分散的重復(fù)性較差;獲得的分裂象染色體分散不足、交叉相對(duì)較多;或者分散過度，導(dǎo)致核型不完整（圖4、5）?；谌旧w分散儀的實(shí)驗(yàn)組染色體制備成功率、染色體重疊交叉少于3條的分裂象個(gè)數(shù)占可供分析分裂象百分比與常規(guī)滴片法相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。見表1。

3 討 ?論

染色體核型分析是染色病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，在產(chǎn)前診斷、出生缺陷防控等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[12]。理想的染色體核型應(yīng)該是分散均勻、相互交疊少、分辨率高、帶紋清晰的。優(yōu)質(zhì)的染色體是核型分析的前提，直接關(guān)系到核型分析的準(zhǔn)確性和病例分析的效率。根據(jù)染色體分散動(dòng)力學(xué)原理，中期染色體的分散質(zhì)量受環(huán)境溫度、濕度和氣流等因素的影響，通過溫度和濕度影響載玻片上固定液的揮發(fā)程度，進(jìn)而影響染色體的分散程度。固定液蒸發(fā)太快，染色體分散不開，固定液蒸發(fā)太慢，染色體卷曲成團(tuán)，太過于分散。濕度和溫度的升高可以增加染色體分散程度，濕度是染色體分散的主要影響因素[7]。本研究利用分散儀提供穩(wěn)定的溫度、濕度環(huán)境進(jìn)行滴片，在此基礎(chǔ)上研究最佳的溫度和濕度組合。研究發(fā)現(xiàn)，隨著相對(duì)濕度的上升，染色體的制備成功率、重疊交叉<3條的核型所占的比例也在不斷升高，但是在超過55%濕度之后，染色體的制備成功率、分散效果呈下降趨勢(shì)。溫度高，濕度低，固定液蒸發(fā)快，染色體還沒來得及分散，玻片已被干燥，造成染色體重疊，此現(xiàn)象在30℃條件下表現(xiàn)尤為明顯。溫度低，濕度高，固定液蒸發(fā)慢，染色體固縮、細(xì)小、不易顯帶，在65%濕度條件下表現(xiàn)明顯。相同濕度條件下，25℃比20℃具有更高的染色體的制備成功率及更好的分散效果。尤其在溫度25℃、55%濕度條件下染色體的制備成功率、分散效果達(dá)到最佳。與韋世錄等[13]基于ChromprepS4恒溫系統(tǒng)對(duì)染色體展開面積進(jìn)行直接測(cè)量研究的最佳溫度30℃、55%濕度的結(jié)論及謝志威等[14]基于Maxchrome染色體分散儀對(duì)染色體展開面積研究認(rèn)為溫度25℃、50%濕度條件下最佳分散效果的結(jié)論存在一些差異。我們分析認(rèn)為一方面與儀器不同有關(guān)，我們的Thermotron Model CDS-5分散儀立體空間大，實(shí)驗(yàn)箱密閉，有可伸進(jìn)手臂的操作孔，相對(duì)獨(dú)立，滴片操作全程均在儀器內(nèi)部預(yù)先設(shè)定好的參數(shù)下進(jìn)行，室溫和室內(nèi)相對(duì)濕度對(duì)滴片干擾不大;而ChromprepS4恒溫系統(tǒng)、Maxchrome染色體分散儀由于恒溫系統(tǒng)與室內(nèi)存在溫度及濕度差，滴片時(shí)儀器抽屜打開，受室內(nèi)溫濕度干擾，儀器抽屜一開一關(guān)過程中，預(yù)設(shè)的溫度與濕度可能有變化，導(dǎo)致以上結(jié)果存在差異。另一方面，謝志威、韋世錄二人通過對(duì)染色體分散面積進(jìn)行直接測(cè)量評(píng)估分散效果，而本研究是從鏡下對(duì)染色體制備條件、分散效果進(jìn)行間接評(píng)價(jià)，可能受實(shí)驗(yàn)人員經(jīng)驗(yàn)、對(duì)染色體優(yōu)良的主觀判斷的影響更大。分散面積大分散效果固然好，但是分散面積太大，也容易存在染色體丟失的情況。因此在評(píng)價(jià)滴片分散效果時(shí)也應(yīng)兼顧核型完整性和核型分析的準(zhǔn)確性。

對(duì)于傳統(tǒng)的染色體制備方法，有的實(shí)驗(yàn)室在室溫下滴片，有的實(shí)驗(yàn)室則在室溫下滴冰水片后于酒精燈上過火，有的采用高位置滴片法，有的采用低位置滴片法，總之都能制備出染色體完成臨床病例的核型分析[15～16]?，F(xiàn)階段大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室均已意識(shí)到滴片時(shí)環(huán)境溫度和濕度對(duì)染色體分散效果的影響，即使通過空調(diào)、加濕器、抽濕機(jī)對(duì)室溫和室內(nèi)濕度進(jìn)行了適當(dāng)控制，依然不能保證實(shí)驗(yàn)室滴片的重復(fù)性、均一性。本研究中Thermotron Model CDS-5分散儀滴片效果與傳統(tǒng)滴片方法相比，不論是在染色體形態(tài)上還是染色體制備成功率、分散效果方面都具有顯著優(yōu)勢(shì)，同時(shí)操作簡便，具有很好的重復(fù)性和均一性。

綜上所述，Thermotron Model CDS-5染色體分散儀實(shí)驗(yàn)箱密閉，有可伸進(jìn)手臂的操作孔，避免有害氣體的傷害。操作簡單，不受實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫濕度影響。每次滴片時(shí)均可設(shè)置相同的溫濕度參數(shù)，滴片環(huán)境穩(wěn)定，染色體分散效果好，保證染色體制備的重復(fù)性和一致性，并獲得較好的染色體質(zhì)量，適用于染色體制備的標(biāo)準(zhǔn)化，有利于染色體核型分析，保證染色體診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性，值得向各實(shí)驗(yàn)室推廣。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2021-07-22 修回日期：2021-11-02）

（編輯：黃研研）