基于對BMP7的調(diào)控探討MEBO對糖尿病創(chuàng)面愈合的影響

唐麗珠 麻華膽 隆采丹 李政 王琳 曾娜 吳標良

【摘要】 目的 通過濕潤燒傷膏（moist exposed burn ointment，MEBO）對骨形態(tài)發(fā)生蛋白7（bone morphogenetic proteins 7，BMP-7）的調(diào)控來探討其對糖尿病創(chuàng)面愈合的影響。

方法 按照隨機數(shù)表將75只Wistar雄性大鼠分為空白組（n=15）、對照組（n=15）、模型組（n=15）、重組牛堿性成纖維細胞生長因子（貝復濟）組（n=15）以及MEBO組（n=15），對模型組、貝復濟組及MEBO組構(gòu)建糖尿病模型。生理鹽水外敷對照組及模型組創(chuàng)面，MEBO組和貝復濟組創(chuàng)面分別給予MEBO、貝復濟外敷。各組于治療后的第1、5、11、18、25天觀察創(chuàng)面大小變化及愈合情況，并于上述各個時間點各組隨機取3只大鼠在麻醉后快速取創(chuàng)面組織并處死大鼠，標本行HE染色觀察創(chuàng)面病理變化及免疫熒光法檢測BMP-7的表達。

結(jié)果 （1）在治療過程中，對照組、貝復濟組、MEBO組的病理形態(tài)明顯改善。（2）BMP-7免疫熒光的變化：除了空白組，其他四組的陽染細胞均升高后降低，具體為第5天出現(xiàn)陽染細胞數(shù)的高峰是對照組、貝復濟組和MEBO組，而第18天達到峰值的是模型組。（3）在模型組、對照組及MEBO組中，BMP-7表達有差異（P<0.05）;而在貝復濟組與MEBO 組中無差異表達（P>0.05）。

結(jié)論 在糖尿病創(chuàng)面組織中，MEBO可能通過調(diào)控BMP-7的表達從而促進潰瘍創(chuàng)面的愈合。

【關(guān)鍵詞】 濕潤燒傷膏;BMP-7;糖尿病潰瘍創(chuàng)面

中圖分類號：R587.2 ? 文獻標志碼：A ? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2021.12.001

【Abstract】 Objective To investigate the effect of moist exposed burn ointment （MEBO） on diabetic wound healing by analyzing its regulation on bone morphogenetic proteins 7 （BMP-7）.

Methods According to random number table method， 75 male Wistar rats were divided into blank group （n=15）， control group （n=15）， model group （n=15）， recombinant bovine basic fibroblast grow （Beifuji） group （n=15） and MEBO group （n=15）. Diabetes models were established in the model group， the Beifuji group and the MEBO group， and the wounds of the model group and the control group were supplied with normal saline， and the wounds of the Beifuji group and the MEBO group were supplied with Beifuji and MEBO， respectively. The changes of wound size and healing were observed on the 1st， 5th， 11th， 18th and 25th days after treatment， and 3 rats in each group were randomly selected at the above time points. After anesthesia， the wound tissue was quickly taken and the rats were killed. The pathological changes of wound were observed by HE staining and the expression of BMP-7 was detected by immunofluorescence.

Results （1） During treatment， the pathological morphology of the control group， the Beifuji group and the MEBO group considerably improved. （2） Changes of BMP-7 immunofluorescence： except the blank group， the positive cells of the other four groups increased and then decreased. Specifically， the peak of the number of positive cells on the 5th day of treatment appeared in the control group， the Beifuji group and the MEBO group， while the model group reached the peak on the 18th day of treatment. （3） There were differences in the expressions of BMP-7 among the model group， the control group and the MEBO group （P<0.05）; however， there were no differences in expressions between the Beifuji group and the MEBO group （P>0.05）.

Conclusion In diabetic wound tissues， MEBO may promote the healing of ulcer ?wounds by regulating the expression of BMP-7.

【Key words】 MEBO; BMP-7; diabetic ulcer wound

糖尿病創(chuàng)面是糖尿病慢性并發(fā)癥之一，它與外周神經(jīng)病變、血管損傷等疾病并列[1]。胰島素抵抗增加、血糖水平升高和炎癥浸潤已經(jīng)被證明是導致傷口愈合延遲的各種因素[2]。在臨床上，糖尿病潰瘍創(chuàng)面是一種常見糖尿病并發(fā)癥。因此有效地促進糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合迫在眉睫。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）是一種蛋白質(zhì)編碼基因，編碼轉(zhuǎn)錄生長因子超家族β;骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號通路調(diào)控不同組織間的細胞增殖、分化和凋亡[3]。研究表明，BMP-7可以通過減少各種炎癥因子的表達，從而減輕創(chuàng)面修復中炎癥及纖維化水平，減少疤痕形成，進而促進創(chuàng)面愈合[4]。因此，在糖尿病創(chuàng)面愈合過程中是否能通過調(diào)控BMP-7而促進創(chuàng)面愈合？研究顯示[5]，濕潤燒傷膏（moist exposed burn ointment，MEBO）可促進糖尿病創(chuàng)面的愈合，提高患者的生活質(zhì)量。本課題組前期細胞研究已證明通過外用MEBO可促進糖尿病大鼠創(chuàng)面中成纖維細胞的增殖，促進創(chuàng)面愈合[6]。本研究通過構(gòu)建糖尿病大鼠創(chuàng)面模型，給予不同干預后，觀察BMP-7的變化，為揭示MEBO通過對BMP-7的調(diào)控參與糖尿病創(chuàng)面愈合提供理論依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1 動物

大鼠75只，3月齡，體重范圍在230～260 g（長沙天勤生物技術(shù)有限公司）。右江民族醫(yī)學院動物倫理委員會批準（批準號：2018112001）。

1.2 主要試劑

MEBO（汕頭市美寶公司）;貝復濟（珠海億勝生物制藥有限公司）;鏈脲佐菌素（Streptozocin，STZ）（北京華越洋生物科技公司）;水合氯醛（成都科龍化工試劑公司）;BMP-7-Antibody（上海文淵閣生物科技公司）;山羊抗兔Ig（中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 分組及造模

按照隨機數(shù)表將75只Wistar雄性大鼠分為空白組（n=15）、對照組（n=15）、模型組（n=15）、重組牛堿性成纖維細胞生長因子（貝復濟）組（n=15）以及濕潤燒傷膏（MEBO）組（n=15），空白組僅給予備皮處理，對照組建立創(chuàng)面模型，行大腿全層皮膚切除，面積約一元硬幣大小;模型組、貝復濟組和MEBO組予以高脂高糖飼養(yǎng)4周后，禁食12 h后行腹腔注射STZ，1周后出現(xiàn)糖尿病癥狀，對存活大鼠進行空腹血糖測定，其空腹血糖值大于16.7 mmol/L，則為造模成功。造模成功后建立創(chuàng)面模型，即切除大腿全層皮膚，面積約2.5 cm×2.5 cm大小，完成創(chuàng)面模型[7]。

1.3.2 標本采集及處理

在創(chuàng)面模型建立后的第1、5、11、18、25天隨機取各組大鼠3只，麻醉后快速行創(chuàng)面組織提取并處死大鼠。部分創(chuàng)面組織用10%福爾馬林固定制作HE染色及切片，其余創(chuàng)面組織置于-80℃冰箱保存。

1.3.3 HE染色觀察病理改變

創(chuàng)面組織固定后依次脫水、透明、浸蠟包埋、切片、烤片、HE染色制片，顯微鏡下觀察成纖維細胞、炎癥細胞、毛細血管及肉芽組織等。

1.3.4 BMP-7免疫熒光

取得的切片在脫蠟水化后進行抗原修復、封閉液封閉、孵育一抗、孵育二抗、染色、封片，熒光顯微鏡下查看熒光細胞染色情況，每張切片采集3個視野，用Image J分析。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行分析，所有數(shù)據(jù)用（±s）表示，采用重復測量方差分析進行比較，根據(jù)是否滿足球性假定選擇相應方法。檢驗水準：α=0.05，雙側(cè)檢驗。

2 結(jié) ?果

2.1 創(chuàng)面肉眼觀

治療第5天，各組呈半干性創(chuàng)面，色素沉著，邊緣結(jié)痂，揭痂后見少許肉芽組織。治療第11天，各組創(chuàng)面無滲液滲出，大部分創(chuàng)面結(jié)痂，揭痂后見大量肉芽組織，創(chuàng)面修復明顯好轉(zhuǎn)。治療第18天，MEBO組大鼠的潰瘍創(chuàng)面基本愈合;模型組大鼠愈合最差。對照組和貝復濟組大鼠其創(chuàng)面干燥及結(jié)痂較多;模型組可見肉芽組織生長，肉芽組織呈顆粒狀。治療第25天，各組大鼠其創(chuàng)面均接近愈合。見圖1。

2.2 創(chuàng)面病理觀察

治療第5天，壞死帶、出血灶及炎癥細胞可見在各組創(chuàng)面組織中，模型組最為明顯。治療第11天，觀察到各組的炎癥細胞浸潤明顯減輕。治療第18天，完整表皮在對照組中可觀察到，貝復濟組、MEBO組見少量成纖維細胞。第25天，完整表皮在各組中可觀察到。見圖2。

2.3 BMP-7免疫熒光染色結(jié)果

在治療過程中，除了空白組，其他四組的陽染細胞均升高后降低。具體為第5天出現(xiàn)陽染細胞數(shù)的高峰是對照組、貝復濟組和MEBO組，而第18天達到峰值的是模型組。治療過程中，除了空白組，其他四組的OD值先升高后下降。見圖3、表1。

3 討 ?論

糖尿病病人常合并不同程度的血管及神經(jīng)病變，故糖尿病潰瘍創(chuàng)面大多數(shù)經(jīng)久不愈。MEBO的主要治療技術(shù)是濕潤暴露療法[8]。在創(chuàng)面組織中，MEBO不僅能夠提供濕潤環(huán)境，而且能夠促進毛細血管的生成以及新生肉芽組織的生長，從而促進創(chuàng)面修復，提高創(chuàng)面愈合質(zhì)量[9～10]。在本研究中，糖尿病慢性創(chuàng)面予MEBO治療，治療后創(chuàng)面炎癥細胞浸潤明顯減輕，直觀表現(xiàn)出更高的愈合率。進一步說明了MEBO在糖尿病創(chuàng)面愈合中的積極作用。

隨著研究的不斷深入，BMPs參與調(diào)節(jié)多種細胞的增殖、生長、遷移[3]。BMP-7是一種有效的抗炎生長因子，屬于TGF-β超家族。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)[4]，BMP-7可減少多種炎癥因子的表達，從而減輕創(chuàng)面修復中炎癥和纖維化水平，減少疤痕形成，促進創(chuàng)面愈合。TGF-β1是導致腎臟纖維化最重要的因子，BMP-7是TGF-β1超家族成員之一，二者通過相似的下游Smad信號通路，彼此反饋調(diào)節(jié)[11]。因此，BMP-7也是重要的抗纖維化因子。

在本次研究的治療過程中，BMP-7陽染細胞明顯升高，表明BMP-7的大量分泌，可減少各種炎癥因子的表達。研究結(jié)果顯示，治療過程中，除了空白組，其他四組的BMP-7表達量均表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢，具體為第5天出現(xiàn)表達量高峰的是對照組、貝復濟組及MEBO組，而第18天達到峰值的是模型組。因此我們認為，在創(chuàng)面早期，機體處于應激狀態(tài)，炎癥細胞因子增多，從而強烈誘發(fā)BMP-Smad信號的傳導，促進BMP-7的表達。但BMP-7的表達可促進成纖維細胞的過度增殖，進而促使了瘢痕的形成[12～14]。從而使對照組、貝復濟組及MEBO組的BMP-7自第5天起逐漸降低，而模型組BMP-7自第18天起逐漸降低，表明在無有效藥物干預下，其成纖維細胞增殖率低，未能充分形成肉芽組織，使得模型組的BMP-7在治療晚期仍保持較高水平，這可能是導致第25天模型組BMP-7的表達量最高。有研究發(fā)現(xiàn)[15]，當疤痕形成后，BMP-7通過負反饋來調(diào)節(jié)機體的表達水平，具體為通過抑制纖維細胞的功能及過度增殖，阻斷其與纖維細胞生成關(guān)系密切的TGF-β1的信號傳導通路，促使纖維細胞凋亡，減少膠原蛋白沉積，從而促進創(chuàng)面愈合。這可能是BMP-7達到高峰后下降的另一原因。

綜上所述，MEBO與貝復濟均可促進糖尿病創(chuàng)面肉芽組織生成、上皮化，能很好地促進糖尿病潰瘍創(chuàng)面的愈合，但MEBO促進創(chuàng)面愈合的效果略佳。我們猜測MEBO促進糖尿病慢性創(chuàng)面愈合的重要途徑之一可能是BMP-Smad信號通路。BMP-Smad信號通路在調(diào)控創(chuàng)面愈合中起重要作用，它能調(diào)控BMP-7的表達，使得BMP-7蛋白表達量改變，從而對創(chuàng)面的愈合起到很好的促進作用。進一步闡明MEBO促進糖尿病潰瘍創(chuàng)面修復的分子機制，為臨床推廣應用MEBO防治糖尿病提供可靠的理論依據(jù)。但不同的信號通路激活與拮抗貫穿整個創(chuàng)面愈合過程，因此需進一步研究BMP-Smad信號通路其他因子。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2021-07-12 修回日期：2021-10-19）

（編輯：潘明志）