多殘留金標(biāo)檢測法在牛奶抗生素殘留檢測中的應(yīng)用

王明利 張 浩

北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系，北京102442

在奶牛的飼養(yǎng)過程中，治療細(xì)菌性疾病需要用到抗生素，而為了預(yù)防疾病有時也會在飼料中添加抗生素，大劑量使用抗生素會造成牛奶藥物殘留，給人體健康帶來危害[1]。另外，隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人民生活水平的提高，人們對生活質(zhì)量和健康日益重視。我國在畜禽生產(chǎn)中禁止和限制使用抗生素有明確規(guī)定?；谏鲜鲈驒z測牛奶中抗生素殘留顯得格外重要[2]。

1 材料與方法

1.1 材 料

1）待檢牛奶樣品。從北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院實訓(xùn)基地采集10 份新鮮牛奶，每份100 mL，分裝在100 mL的藍(lán)蓋瓶里，牛奶經(jīng)過檢測無氟喹諾酮類和氨基糖苷類藥物殘留，冰箱4 ℃冷藏備用。

2）標(biāo)準(zhǔn)品。選擇比較關(guān)注的抗生素殘留的9 類藥物，分別為氨基糖苷類藥物、氟喹諾酮類藥物、頭孢類藥物、磺胺類藥物、大環(huán)內(nèi)酯類藥物、激素類藥物、青霉素類藥物、氯霉素類藥物和四環(huán)素類藥物。每類藥物中選擇1~6 種抗生素標(biāo)準(zhǔn)品。標(biāo)準(zhǔn)品溶液均購自北京譜析科技有限公司，其溶液濃度及規(guī)格見表1。

3）多殘留金標(biāo)快速檢測卡。批號：MUL MI01862053、MULMI01862058 和MULMI01862137，由北京某生物科技有限公司提供。

4）主要器材。分析天平（AEL-120 型，日本島津公司生產(chǎn)）；微量移液器（大龍，上海漢林實驗儀器有限公司生產(chǎn)）；微型旋渦混合儀（WH-2 型，上海滬西分析儀器廠生產(chǎn)）； 海爾冰箱（BCD -629WDEYU1）；10、20、100 mL 容量瓶；2 mL EP 管（帶管架）；移液器吸頭和配套吸頭盒等。

1.2 方 法

1）標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。

①檢測卡靈敏度標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。配制9 種標(biāo)準(zhǔn)溶液的貯備液：濃度為10 μg/mL 的慶大霉素和卡那霉素；濃度為5 μg/mL 氧氟沙星、諾氟沙星、那氟沙星、恩諾沙星、依諾沙星、沙拉沙星；配制以上6種氟喹諾酮類藥品標(biāo)準(zhǔn)品溶液的混和液，其濃度均為5 μg/mL，冰箱4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 抗生素標(biāo)準(zhǔn)品的種類及濃度

配制濃度為10 μg/mL 慶大霉素貯備液：用1 mL 移液器吸取1 mL 1 000 μg/mL 慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，沿著內(nèi)壁緩緩注入100 mL 容量瓶中，用純凈水沖洗槍頭3 次并將沖洗液注入容量瓶，再用純凈水定量至容量瓶刻度，搖勻，靜置備用。

配制濃度為10 μg/mL 卡那霉素貯備液：用1 mL 移液器吸取1 mL 100 μg/mL 卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，沿著內(nèi)壁緩緩注入10 mL 帶底座的容量瓶中，用純凈水沖洗槍頭3 次并將沖洗液注入容量瓶，再用純凈水定量至容量瓶刻度，搖勻，靜置備用。

在但采爾幫助下，蔡元培陪周養(yǎng)浩于11月21日“到大學(xué)報名”。接下去的一年里，蔡元培則利用夫人注冊入學(xué)的便利，了解漢堡大學(xué)有關(guān)民族學(xué)的課程，借閱圖書館的圖書，潛心研究民族學(xué)。期間，他多次拒絕主持北大校務(wù)的蔣夢麟和北大評議會要他回國主持校務(wù)的請求。在1925年1月3日致北京大學(xué)評議會的信中，蔡元培云：“自去年十月起，即屏除一切，專心求學(xué)。冀再歷一二年，稍有所得，以副研究之名。若此時輟業(yè)而歸，則所謂何所聞而來、何所見而去，不特自問難安，而亦無以副本校特別優(yōu)待之盛意?！盵8]227

配制濃度為5 μg/mL 氧氟沙星貯備液：用1 mL 移液器吸取1 mL 100 μg/mL 氧氟沙標(biāo)準(zhǔn)品溶液，沿著內(nèi)壁緩緩注入10 mL 帶底座的容量瓶中，用純凈水沖洗槍頭3 次并將沖洗液注入容量瓶，再用純凈水定量至容量瓶刻度，搖勻，靜置2 min，制備成濃度為10 μg/mL 氧氟沙星貯備液；再用5 mL移液器吸取5 mL 10 μg/mL 氧氟沙星貯備液，沿著內(nèi)壁緩緩注入10 mL 帶底座的容量瓶中，用純凈水沖洗槍頭3 次并將沖洗液注入容量瓶，再用純凈水定量至容量瓶刻度，搖勻、靜置2 min，備用。制備成濃度為5 μg/mL 氧氟沙星貯備液。

配制濃度為5 μg/mL 的諾氟沙星、那氟沙星、恩諾沙星、依諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品的貯備液：標(biāo)準(zhǔn)品濃度均為100 μg/mL，配制方法同氧氟沙星。

配制濃度為5 μg/mL 沙拉沙星貯備液：用1 mL 移液器吸取1 mL 100 μg/mL 沙拉沙星標(biāo)準(zhǔn)品溶液，沿著內(nèi)壁緩緩注入20 mL 帶底座的容量瓶中，用純凈水沖洗槍頭3 次并將沖洗液注入容量瓶，再用純凈水定量至容量瓶刻度，搖勻，靜置備用。

配制6 種氟喹諾酮類藥品濃度為5 μg/mL 的混和液：用移液器分別取濃度為100 μg/mL 的氧氟沙星、諾氟沙星、那氟沙星、恩諾沙星、依諾沙星各1~20 mL 帶底座的容量瓶中，再取1 mL 濃度為10 μg/mL（取配制沙拉沙星1 000 μg/mL 1~100 mL）沙拉沙星溶液至這個容量瓶，純凈水定容至刻度線，搖勻靜置，冰箱4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

②檢測卡特異性標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的化學(xué)特性配制不同標(biāo)準(zhǔn)品溶液，慶大霉素和卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品貯備液的濃度為100 μg/mL，氟喹諾酮類貯存液的濃度為50 μg/mL，4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

配制100 μg/mL 慶大霉素溶液：用1 mL 移液器吸取1 mL 1 000 μg/mL 慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，沿著內(nèi)壁緩緩注入10 mL 帶底座的容量瓶中，用純凈水沖洗槍頭3 次并將沖洗液注入容量瓶，再用純凈水定量至容量瓶刻度，搖勻、靜置備用。

配制100 μg/mL 卡那霉素溶液：采購的標(biāo)準(zhǔn)品濃度為100 μg/mL，直接用于試驗。

2）檢測卡的靈敏度試驗。

①檢測卡靈敏度試驗具體操作方法：將牛奶陰性樣品配制成慶大霉素濃度為0.00、0.05、0.10 和0.15 μg/mL 樣品[3]，每種濃度樣品10 份，配制4 個濃度卡那霉素的牛奶樣品各10 份；配制氟喹諾酮類混合標(biāo)準(zhǔn)品牛奶樣品各10 份，濃度分別為0.00、0.025、0.050 和0.100 μg/mL，每份樣品為10 mL[3]。冰箱4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

②配制0.05 和0.10 μg/mL 慶大霉素的牛奶樣品：用移液器吸取1 mL 濃度為10 μg/mL 的慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，沿頸口內(nèi)壁緩緩注入100 mL 容量瓶，吸頭用牛奶沖洗3 次，并將清洗液注入容量瓶中，用牛奶定容，搖勻，靜置備用。制備成濃度為0.1 μg/mL 慶大霉素的牛奶溶液；0.1 μg/mL 慶大霉素的牛奶溶液稀釋2 倍，制備成0.05 μg/mL 慶大霉素的牛奶溶液；每種濃度溶液配制100 mL 分裝成10 份備用。

③配制0.015 μg/mL 慶大霉素的牛奶溶液：用移液器吸取150 μL 至100 mL 容量瓶，用牛奶定容至刻度，搖勻、靜置，4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

④制備0.1 μg/mL 和1 μg/mL 抗生素牛奶樣品：將2 mL 的EP 管編號1~20 放置在EP 管架上，用1 mL 移液器分別吸取1 mL 鮮奶樣品放置在20支EP 管里，防止重復(fù)和遺漏，移液器吸取1 μL 濃度為100 μg/mL 的慶大霉素、卡那霉素溶液等氨基糖苷類、頭孢類藥物等20 種標(biāo)準(zhǔn)液依次放入20 個EP 管內(nèi)，反復(fù)吹打使牛奶與抗生素混勻。制備成抗生素濃度為0.1 μg/mL 的牛奶樣品。用同樣的方法制備抗生素濃度為1.0 μg/mL 的牛奶樣品，編號1~20（吸取10 μL 100 μg/mL 抗生素至1 mL 牛奶中）。

⑤制備0.05 μg/mL 和0.5 μg/mL 抗生素牛奶樣品（氟喹諾酮類）制備方法同上，用于特異性試驗。

3）檢測卡靈敏度檢測試驗方法。選取已經(jīng)配制的慶大霉素、卡那霉素和氟喹諾酮類藥物4 種濃度的樣品奶，按照檢測卡的操作步驟進(jìn)行檢測，每份牛奶樣品用3 個批號的檢測卡檢測，3 個重復(fù)，每份牛奶樣品檢測9 次[4]，觀察結(jié)果。確定檢測卡的靈敏度。

4）檢測卡特異性檢測試驗方法。將上述配制的不同抗生素濃度為0.1 μg/mL 和1 μg/mL 的牛奶樣品，用3 個不同批號的檢測卡進(jìn)行檢測，確定檢測卡的特異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測卡靈敏度的測定

由表2 可知，檢測卡進(jìn)行靈敏度試驗，慶大霉素和卡那霉素的靈敏度均為0.100 μg/mL，氟喹諾酮類藥物混和液靈敏度為0.05 μg/mL。

2.2 檢測卡特異性的測定

由表3 可知，利用多殘留金標(biāo)檢測卡，檢測上述人為殘留牛奶樣品。慶大霉素和卡那霉素濃度為0.1 μg/mL 和1 μg/mL 的牛奶樣品，均顯示陽性，鏈霉素、新霉素、雙氫鏈霉素和大觀霉素濃度為0.1 μg/mL 和1 μg/mL 的牛奶樣品均顯示陰性，說明檢測卡在檢測牛奶中氨基糖苷類藥物殘留時只能檢出慶大霉素和卡那霉素，而對其他同源或不同源藥物無交叉反應(yīng)；氧氟沙星、依諾沙星、恩諾沙星、諾氟沙星和那氟沙星這5 種抗生素濃度為0.1 μg/mL和1 μg/mL 的牛奶樣品均顯示陽性；沙拉沙星濃度在0.1 μg/mL 顯陰性，1 μg/mL 顯陽性，說明檢測卡在檢測氟喹諾酮類藥物殘留時可以檢出大多數(shù)藥物，同源的少數(shù)藥物達(dá)到一定濃度（0.5 μg/mL）可以檢出，且與其他非同源藥物間不存在交叉反應(yīng)，頭孢類、磺胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、激素類、青霉素類、氯霉素類和四環(huán)素類和幾種藥濃度為0.1 μg/mL 和1 μg/mL 的牛奶樣品均顯示陰性。試驗檢出結(jié)果對照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部235 公告[5]，檢測卡檢出的殘留量低于國家許可的殘留限量要求[6]。

3 結(jié) 論

本試驗所用的多項抗生素藥物殘留試劑卡基本原理為抗原抗體金標(biāo)免疫法，此檢測卡可以檢測慶大霉素、卡那霉素和氧氟沙星等6 種氟喹諾酮類藥物，其靈敏度分別為0.100、0.100、0.050 μg/mL。強(qiáng)調(diào)一點，本試驗檢測氟喹諾酮類的靈敏度0.050 μg/mL，檢測的為氟喹諾酮類藥物含量的總和。該試劑卡具有較強(qiáng)的特異性，與非同源的其他抗生素沒有交叉反應(yīng)。

表2 檢測卡靈敏度檢測試驗結(jié)果

表3 多殘留金標(biāo)檢測卡檢測藥殘牛奶的結(jié)果

試劑卡具有操作步驟簡單、方便快捷、穩(wěn)定性好、特異敏感、結(jié)果判斷直觀，同時不受環(huán)境約束等特點，適用于基層、現(xiàn)場大量樣品同時篩查及普查工作。在乳品抗生素殘留檢測中具有廣闊的應(yīng)用前景。