2株益生菌對抑郁模型大鼠行為學(xué)和腸道菌群的影響

屈 婉，劉 碩，馬 晨，閆 鶴*

（1 華南理工大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院 廣州510640 2 無限極（中國）有限公司 廣州510627 3 北京科拓恒通生物技術(shù)股份有限公司 北京101407）

世界衛(wèi)生組織（WHO）全球疾病負(fù)擔(dān)評估報告顯示，抑郁癥是危害人類健康的第二大殺手，影響著3 億人的健康且其危害程度在不斷擴(kuò)大[1-2]。傳統(tǒng)的治療方式為抑制神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)（血清素、去甲腎上腺素及多巴胺等）再攝取[3-4]。最新研究表明，腸道菌群紊亂與多種疾病的發(fā)生有著密切聯(lián)系，如糖尿病、腸易激綜合征、抑郁癥等疾病[5-7]。腸道菌群作為人類的第二大腦，可通過自身或其代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸等影響機(jī)體健康，同時機(jī)體也可以通過神經(jīng)傳導(dǎo)、免疫調(diào)節(jié)及神經(jīng)內(nèi)分泌途徑調(diào)節(jié)腸道菌群，這種相互作用機(jī)制被稱為“微生物-腸-腦軸”（Microbiota-Gut-Brain Axis，MGBA）[8]。MGBA 引起人們的廣泛關(guān)注，成為多種疾病的重點(diǎn)關(guān)注方向，其中抑郁癥也不例外。有研究顯示，抑郁癥患者的腸道菌群與正常人群的不同，多發(fā)生紊亂，表現(xiàn)為alpha 多樣性顯著降低，厚壁菌門與擬桿菌門的比例顯著升高，說明腸道微生物結(jié)構(gòu)的改變影響了腦神經(jīng)發(fā)育[9-11]。還有一些研究結(jié)果顯示，抑郁癥患者的腸道中擬桿菌目和梭菌屬豐度顯著升高，而毛螺旋菌科豐度顯著降低，說明腦神經(jīng)發(fā)育可能與特定物種的豐度變化有關(guān)[12-13]。另外，有研究表明90%以上的血清素由腸道合成[14-15]。血清素是一種不可或缺的神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)，該物質(zhì)匱乏可導(dǎo)致抑郁發(fā)生。綜上可知，腸道菌群平衡與宿主健康存在著密不可分的聯(lián)系。

現(xiàn)有研究表明，益生菌可通過調(diào)節(jié)腸道環(huán)境的酸堿平衡、代謝和腸黏膜屏障來維持腸道平衡，這對疾病的預(yù)防和治療都有重要意義[16]。另有研究顯示，鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）可通過迷走神經(jīng)途徑調(diào)節(jié)小鼠情緒和伽馬羥基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）受體的表達(dá)量[17-18]，雙歧桿菌（Bifidobacterium）的補(bǔ)充可一定程度上預(yù)防慢性壓力刺激下抑郁癥狀的發(fā)生[19-20]。前期研究表明，植物乳桿菌P-8（P-8）及乳雙歧桿菌BB-12（BB-12）不含有對人體存在潛在威脅的基因，同時還具有較強(qiáng)的抗菌能力且定植時間較長，并且臨床研究結(jié)果顯示，P-8 不僅可以緩解抑郁人群的壓力和焦慮，還可以增強(qiáng)其記憶和認(rèn)知能力[21-22]。

目前關(guān)于益生菌輔助治療抑郁的研究頗多，大多以其作用機(jī)制為出發(fā)點(diǎn)研究其對情緒調(diào)節(jié)及菌群結(jié)構(gòu)的影響，而對腸道菌群組成及功能影響的研究較少。本文旨在探究益生菌 （P-8 和BB-12）對慢性壓力誘導(dǎo)抑郁模型大鼠的情緒及其腸道菌群結(jié)構(gòu)、組成和功能的影響，為其使用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF 級SD 大鼠[雄性，體重（200±20）g]，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心 [許可證號：SCXK（粵）2013-002]，飼養(yǎng)于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心SPF 級屏障環(huán)境內(nèi)。

1.2 材料與試劑

乳雙歧桿菌BB-12 （Bifidobacterium lactis BB-12）粉劑，丹麥科漢森公司；植物乳桿菌P-8（Lactobacillus plantarum P-8）粉劑，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部乳品生物技術(shù)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

QIAmp DNA Mini Kit，凱杰；Qiagen Gel Extraction Kit，凱杰；蔗糖，天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.3 儀器與設(shè)備

Bio-rad T100 梯度PCR 儀，美國Bio-rad 公司；NanoDrop 2000，賽默飛。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 動物分組及處理 42 只SPF 級SD 雄性大鼠參考文獻(xiàn)[23-24]中的處理方法，在正式試驗(yàn)開始前適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周 （12 h 晝/夜，溫度25 ℃±1℃，濕度55%～65%），大鼠1 只/籠，在此期間進(jìn)行糖水偏好訓(xùn)練，糖水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機(jī)將其劃分成2 個組：一組為健康對照組（HC，n=6），另一組為CUMS 抑郁模型組（n=36）。建模8 周后，行為學(xué)測試檢驗(yàn)，抑郁模型構(gòu)建成功的抑郁模型鼠被隨機(jī)分成3 組：BB-12 添加組（n=4），灌胃乳雙歧桿菌BB-12；P-8 添加組（n=4），灌胃植物乳桿菌P-8；模型對照組（CUMS，n=5），灌胃無菌水。然后，進(jìn)行為期6 周的益生菌補(bǔ)充試驗(yàn)，根據(jù)前人研究確定大鼠的受試劑量分別是：BB-12 為1×109CFU/d，P-8 為5×109CFU/d[17，25]。灌胃前，將菌粉溶于生理鹽水中制成菌懸液，現(xiàn)配現(xiàn)用。益生菌干預(yù)期間，各CUMS 抑郁模型大鼠繼續(xù)給予應(yīng)激刺激，健康對照組飼養(yǎng)在安靜舒適的環(huán)境里自由獲取食物和水。最后，各組大鼠糞便樣本在末次補(bǔ)充益生菌24 h 后被收集，保存于-80 ℃冰箱，用于腸道菌群分析。

綜上，該試驗(yàn)是一個為期15 周的益生菌補(bǔ)充試驗(yàn)，包括1 周適應(yīng)性飼養(yǎng)期、8 周抑郁模型構(gòu)建期及6 周的益生菌干預(yù)期。試驗(yàn)期間，大鼠體重每周稱量1 次，糖水偏好試驗(yàn)、曠場試驗(yàn)和明暗穿梭試驗(yàn)在益生菌補(bǔ)充前后執(zhí)行。益生菌補(bǔ)充試驗(yàn)完成后采集糞便樣本，進(jìn)行腸道菌群分析。

1.4.2 模型構(gòu)建 參考前人研究處理方法[26-27]，構(gòu)建大鼠抑郁模型，主要采用慢性、不可預(yù)知性刺激且聯(lián)合孤養(yǎng)的方式。刺激方式主要包括8 種，每日隨機(jī)選取1 種刺激，連續(xù)2 d 的刺激方式不可重復(fù)，每種刺激平均執(zhí)行次數(shù)相似。

1.4.3 模型評價標(biāo)準(zhǔn) 參考前人的評價標(biāo)準(zhǔn)[28-30]對大鼠進(jìn)行體重計(jì)量及3 項(xiàng)行為學(xué)測試（體重、糖水偏好試驗(yàn)、曠場試驗(yàn)及明暗穿梭試驗(yàn)），最終以大鼠的體重、糖水偏好率、曠場得分及暗處所處時間3 項(xiàng)行為指標(biāo)綜合衡量模型鼠是否呈抑郁狀態(tài)。

1.4.4 腸道菌群16S rRNA V4-V5 區(qū)高通量測序 首先，每周采取大鼠糞便，提取大鼠糞便菌群DNA；其次，對腸道菌群DNA 的16S rRNA V4-V5 區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增；然后，建庫、測序；最后，基于有效測序結(jié)果進(jìn)行聚類和物種分類分析，以可操作性的生物學(xué)單元為單位 （Operational Taxonomic Units，OTUs），根據(jù)OTUs 聚類結(jié)果，一方面可得到物種信息和物種豐度，另一方面還可以對OTUs 進(jìn)行alpha 多樣性 （Chao1/Ace 指數(shù)、Simpson/Shannon 指數(shù)）、非度量多維尺度分析（Nonmetric Multidimensional Scaling，NMDS）。為進(jìn)一步挖掘各組間腸道菌群差異，選用單尾單因素方差分析（ANOVA）對各組物種進(jìn)行差異統(tǒng)計(jì)顯著性檢驗(yàn)，同時還采用PICRUSt 進(jìn)行功能預(yù)測分析。

1.5 結(jié)果統(tǒng)計(jì)

行為學(xué)試驗(yàn)結(jié)果和腸道差異物種統(tǒng)計(jì)采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行T 檢驗(yàn)及ANOVA，P＜0.05，認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 益生菌對CUMS 抑郁大鼠情緒的影響

2.1.1 益生菌干預(yù)下CUMS 抑郁大鼠體重的變化由圖1可以看出，在第9 周之前，CUMS 模型組體重增長速度較健康對照組慢。在第9 周之后，相比于CUMS 組，BB-12 組及P-8 組的體重雖仍低于HC 組，但增長速度較模型組明顯加快。經(jīng)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，4 個組體重在整個試驗(yàn)周期內(nèi)差異均不顯著，推斷可能是個體消化吸收情況不同導(dǎo)致組內(nèi)體重差異較大的結(jié)果。體重變化結(jié)果表明，乳雙歧桿菌BB-12 及植物乳桿菌P-8 均能促進(jìn)大鼠體重增長。

2.1.2 益生菌補(bǔ)充對CUMS 抑郁大鼠行為的影響3 個不同的行為學(xué)表現(xiàn)反映不同的行為學(xué)特征，糖水偏好試驗(yàn)反映了大鼠快感的缺失程度，曠場試驗(yàn)體現(xiàn)動物的活躍程度，明暗穿梭試驗(yàn)則反映動物探索未知的能力。如表1所示，在建模開始前的第1 周，2 組糖水偏好程度差異不大，都在90%以上。經(jīng)過8 周的建模后，CUMS 組的糖水偏好率、曠場得分及在暗處所處時間與HC 組相比均存在極顯著差異（P＜0.01）。

圖1 益生菌補(bǔ)充前、后大鼠體重變化Fig.1 Changes in body weight of rats before and after probiotic supplementation

而由表2可以看出，益生菌補(bǔ)充6 周后，BB-12 及P-8 組的糖水消耗率及曠場得分相比于CUMS 組均顯著升高（P＜0.05），且2 個益生菌添加組大鼠在暗處所處時間相比于CUMS 組都明顯縮短，但僅有植物乳桿菌P-8 組達(dá)到差異顯著（P＜0.01）。綜上可知，2 株益生菌均顯著改善了CUMS抑郁大鼠的抑郁癥狀，但植物乳桿菌P-8 組改善效果更加明顯。

表1 益生菌補(bǔ)充前各組行為學(xué)結(jié)果Table 1 The result of behavior tests before probiotics supplementation

表2 益生菌補(bǔ)充后行為學(xué)結(jié)果Table 2 The result of behavior tests after probiotics supplementation

2.2 益生菌補(bǔ)充對腸道菌群多樣性的影響

由表3可知，各組大鼠腸道菌群的豐富度及多樣性無明顯差異，僅有模型對照組的Chao1 指數(shù)顯著高于健康對照組（P＜0.05），這和Strati等[10，12]研究結(jié)果一致。菌群多樣性結(jié)果說明，補(bǔ)充益生菌不一定能提高腸道菌群的豐富度及多樣性，或許是各組大鼠食用相同食物和水的結(jié)果，因?yàn)轱嬍呈撬茉炷c道菌群的一個重要因素[31]。

表3 4 組糞便樣品物種豐富度及多樣性Table 3 Species richness and diversity of four groups’ feces

2.3 益生菌對腸道菌群結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)作用

NMDS 分析體現(xiàn)的是各組間菌群結(jié)構(gòu)差異情況，兩組間距離越近，說明兩組間的腸道微生物結(jié)構(gòu)越相似；反之，則群落結(jié)構(gòu)差異越大。由圖2非度量多維尺度分析可知，健康對照組和模型對照組菌群結(jié)構(gòu)差異較大；而相比于模型對照組及健康對照組，2 株益生菌添加組的菌群結(jié)構(gòu)被顯著調(diào)節(jié)。

2.4 益生菌對腸道群落組成的影響

2.4.1 益生菌干預(yù)后腸道優(yōu)勢物種的變化 如圖3所示，各組大鼠腸道優(yōu)勢OTUs 主要包含OTU239、OTU237、OTU258、OTU52、OTU291、OTU475、OTU509、OTU437、OTU590 和OTU178，其 中OTU239 和OTU237 屬于乳酸菌屬，OTU258 屬于Romboutsia 菌屬，OTU52、OTU291、OTU475、OTU509、OTU437 和OTU590 屬于擬桿菌科，OTU178 屬于普雷沃氏菌屬。另外，經(jīng)慢性壓力刺激后菌群組成發(fā)生明顯變化，益生菌干預(yù)后群落組成得到調(diào)整 （如OTU237、OTU52、OTU291 和OTU475）。

圖2 基于OTU 水平的NMDS 分析Fig.2 Analysis of nonmetric multidimensional scaling based on the OTU level

圖3 各組大鼠糞便菌群OTU 水平相對豐度Fig.3 Relative abundance of dominant OTUs in fecal microbial communities from different groups

2.4.2 益生菌補(bǔ)充后腸道特定微生物豐度的變化為進(jìn)一步探究各組間物種的差異，進(jìn)行了OTU水平單因素方差分析，結(jié)果如圖4所示，各組大鼠腸道中OTU556（g_Ruminococcaceae_UCG-014）、OTU198（f_Bacteroidales_S24-7_group）、OTU194（g_Ruminiclostridium）、OTU99 （f_norank_o_Mollicutes_RF9）的相對豐度在統(tǒng)計(jì)學(xué)上存在顯著差異（P＜0.05）。Ruminococcaceae_UCG-014 是瘤胃菌科中的一個菌屬，該菌屬具有抗炎性功能[32]，為緩解慢性壓力引起的炎癥反應(yīng)，該菌屬在模型對照組中顯著升高，兩益生菌添加組中該菌屬的豐度均顯著降低。Bacteroidales_S24-7_group 屬于擬桿菌門，該菌科豐度在模型對照組中顯著降低（P＜0.01），可貢獻(xiàn)擬桿菌門豐度降低，進(jìn)而導(dǎo)致厚壁菌門與擬桿菌門比例失調(diào)，該比例失調(diào)與抑郁的發(fā)生存在重要聯(lián)系[10-11]，植物乳桿菌P-8 顯著提升了該菌科的豐度（P＜0.05）。而Ruminiclostridium和norank_o_Mollicutes_RF9 在抑郁發(fā)生過程中是否發(fā)揮了作用是未知的，但由本試驗(yàn)結(jié)果可知它們在菌群中占比的改變對抑郁的發(fā)生及相應(yīng)的治療都有一定的影響。因此，由以上結(jié)果可推斷，益生菌可通過調(diào)節(jié)特定物種的豐度發(fā)揮其抗抑郁功能。

圖4 4 組大鼠基于OTU 水平的相對豐度比較Fig.4 Comparison of relative abundance at the OTU level between four groups

2.5 益生菌對腸道微生物功能的影響

通過KEGG （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）功能數(shù)據(jù)庫比對，獲得254 個預(yù)測功能，統(tǒng)計(jì)分析得到8 個具有顯著差異的功能。由圖5可以看出，相比于健康對照組，β-丙氨酸代謝、氨基苯甲酸鹽降解作用、?；撬岷蛠喤；撬岽x、檸檬烯和松萜降解作用、甲苯降解作用和香葉醇降解作用在模型對照組中顯著降低，益生菌補(bǔ)充后雖富集了相關(guān)基因，但均不顯著；青霉素和頭孢菌素合成作用在模型對照組中顯著升高，2 種益生菌均未減弱該功能；糖胺聚糖降解作用在模型對照組中降低，但差異不顯著，經(jīng)乳雙歧桿菌BB-12 調(diào)節(jié)后該功能顯著強(qiáng)于模型對照組。其中β-丙氨酸代謝差異，驗(yàn)證了Zheng 等[33]的抑郁小鼠腸道微生物氨基酸代謝紊亂的結(jié)論。由功能差異結(jié)果可知，抑郁大鼠腸道微生物功能與健康大鼠功能差異較大，且經(jīng)過短期的益生菌干預(yù)僅能一定程度的緩解。

圖5 4 組大鼠腸道微生物的功能比較Fig.5 Comparison of gut microbial functions between four groups

3 結(jié)論

2 株益生菌均可緩解慢性壓力誘導(dǎo)的快感缺乏、認(rèn)知及探索未知的障礙，且能調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)及特定物種的豐度，如乳雙歧桿菌BB-12 顯著降低了OTU556、OTU194 和OTU99 的豐度，植物乳桿菌P-8 顯著調(diào)節(jié)了OTU556、OTU194、OTU99和OTU198 的豐度，還能一定程度上緩解慢性壓力刺激引起的腸道微生物功能紊亂。由此說明，乳雙歧桿菌BB-12 和植物乳桿菌P-8 均可通過調(diào)節(jié)腸道菌群的結(jié)構(gòu)、組成和功能緩解慢性壓力誘導(dǎo)的抑郁癥狀，進(jìn)一步明確了益生菌對抑郁患者的情緒改善機(jī)制，為其使用提供了理論依據(jù)。