藻藍色素蛋白誘導非小細胞肺癌H1299細胞凋亡的機制

郝 帥，李前程，李 爽，劉媛璞，王 靜，王成濤

（北京市食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 北京市食品添加劑工程技術研究中心北京工商大學食品與健康學院 北京100048）

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一[1]，具有很高的發(fā)病率和致死率[2]。其中，作為肺癌的一種亞型，非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的發(fā)病率高達85%[3]，嚴重危害人類健康。不僅如此，非小細胞肺癌還具有較高的浸潤能力和術后復發(fā)率。對于非小細胞肺癌的治療仍然面臨許多挑戰(zhàn)。

藻藍色素蛋白（C-Phycocyanin，C-PC）是一種源于螺旋藻、藍藻細胞中的捕光蛋白，在藻體細胞內以六聚體的結構存在[4]，吸收光譜為615～640 nm[5]。在GB 2760-2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》中，藻藍被列為我國允許使用的天然食品著色劑，可用于飲料、糕點、糖果等食品生產中。除了能作為食用色素廣泛用于食品行業(yè)，藻藍色素蛋白同時具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多種生理功能[6]。目前，有報道證實藻藍蛋白對包含肺癌在內的多種腫瘤細胞系具有促進凋亡，抑制增殖遷移的作用[7-11]。例如，Pardhasaradhi 等[8]發(fā)現藻藍蛋白對組織細胞瘤AK-5 細胞具有較強的抑制作用；Subhashini 等[9]發(fā)現藻藍蛋白能夠促進慢性白血病細胞K562 的凋亡；Liao 等[10]則通過研究證實了藻藍蛋白對胰腺癌細胞的體內外抑制效應。縱觀目前的研究現狀，大量的研究表明藻藍蛋白具有非常優(yōu)良的腫瘤抑制作用，而對于其中調控機制的報道還非常少。鑒于藻藍蛋白所具有的天然、安全、抗腫瘤等優(yōu)良特性，深度研究其抗癌調控機制具有重要意義，可為非小細胞肺癌的治療提供新思路。

本實驗室前期研究證實藻藍蛋白對非小細胞肺癌H1299 細胞具有促凋亡、抑增殖的作用[7]，具體的調控機制尚不明確。為了探究藻藍蛋白在非小細胞肺癌中的調控機理，本文以高通量檢測技術為手段，對藻藍蛋白處理過的H1299 細胞進行轉錄組分析，篩選潛在的調控靶點，檢測細胞凋亡和增殖能力。本研究結果為深入揭示藻藍蛋白在非小細胞肺癌中的作用機制，以及為功能性食用色素的抗腫瘤治療提供了新的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人類非小細胞肺癌NCI-H1299 細胞系（以下簡稱H1299 細胞系）由本實驗室（北京市食品添加劑工程技術研究中心）保存；藻藍蛋白標準品由內蒙古農業(yè)大學惠贈。

轉染試劑Lipofectamine3000，美國Invitrogen公司；TIRAP 多克隆抗體，美國Immunoway 公司；NF-κB 信號通路抗體試劑盒、Bax/Bcl-xL 多克隆抗體，美國Cell Signaling Technology 公司；TIRAP siRNA、Negative control siRNA （Neg.siRNA），上海吉瑪制藥有限公司，其中siRNA 序列設計如表1。

表1 siRNA 序列Table 1 Sequences of siRNA segments

1.2 儀器與設備

CFX96 Touch 熒光定量PCR 儀、SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳儀，美國Bio-Rad 公司；SpectraMax i3 多功能酶標儀，美國MD 公司；Phantom9900XL掃描儀，MICROTEK 公司；恒溫CO2細胞培養(yǎng)箱，Heraeus Eppendorf 公司；流式細胞儀，美國BD 公司；X-Ray 洗片機，上海德沐泰鈳科貿有限公司；NANODROP2000 濃度測定儀、高速冷凍離心機，美國Thermo 公司；恒溫水浴振蕩器、超凈臺，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) H1299 細胞采用含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM 培養(yǎng)基，置于37 ℃，5% CO2恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期傳代，將用于試驗的細胞狀態(tài)調整至最佳。

1.3.2 細胞的siRNA 轉染 將適量細胞鋪于六孔板、60 mm 培養(yǎng)皿過夜培養(yǎng)，當細胞匯合度達到30%～50%時進行細胞轉染。準備適量無RNA 酶的進口EP 管，按照轉染試劑Lipofectamine 3000說明書操作，取適量Lipofectamine 3000（使用前輕輕搖勻），用Opti-MEM 培養(yǎng)基稀釋，輕輕混和。在另一EP 管中取適量TIRAP siRNA，用Opti-MEM 培養(yǎng)基稀釋，輕輕吹打混合，隨后將兩管混合物混勻。室溫孵育10 min，最后將轉染復合物均勻滴加到細胞中，培養(yǎng)48～72 h 用于后續(xù)相關試驗。在轉染時，同時設置Negative siRNA 轉染組為陰性對照組。

1.3.3 細胞生長曲線的測定 采用MTT 法測定H1299 細胞的生長曲線。將轉染的細胞鋪于96 孔板中，待細胞貼壁后加入含有10% MTT 的完全培養(yǎng)基100 μL，放置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～6 h，再加入同體積的SDS-HCL 裂解液，12 h 后測定570，630 nm 處吸光值。以630 nm 吸光值作為參考，每組4 個副孔作為平行，連續(xù)檢測6 d 吸光值，記錄數據繪制細胞生長曲線。

1.3.4 倒置顯微鏡觀察H1299 細胞形態(tài)學變化配制含4.8 μmol/L 濃度的藻藍蛋白的培養(yǎng)基，處理H1299 細胞，培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，棄去培養(yǎng)基并用PBS 洗滌2 次，倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化，拍照保存。同樣，沉默TIRAP 的H1299 細胞轉染后放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，當出現形態(tài)變化時，拍照保存。

1.3.5 定量PCR（qRT-PCR）檢測TIRAP 基因轉錄水平表達 TRIZOL 法提取轉染TIRAP siRNA，Neg.siRNA 的H1299 細胞的總RNA，在超凈臺中吹干RNA，加入適量DEPC 水溶解，反復吹打混勻，使RNA 充分溶解。根據濃度計算2 μg 質量的RNA 體積，作為反轉錄cDNA 的模板，反轉錄體系為20 μL，加入5×gDNA Buffer 2 μL，再用DEPC 水補齊到10 μL，簡短離心，放置42 ℃，孵育3 min，加入下一步的Mix。Mix 體系為10×FastRT Buffer 2 μL，RT EnzymeMix 1 μL，FQ-RT Primer Mix 2 μL，RNase-Free ddH2O 5 μL，42 ℃孵育15 min，95 ℃孵育3 min，4 ℃保存。剩余RNA可放于-80 ℃冰箱保存。qRT-PCR 反應體系為20 μL，程序設置采用3 步法，設計引物序列如表2（GAPDH 為內參基因）。

表2 用于定量PCR 的引物序列Table 2 Primer sequences of qRT-PCR

1.3.6 蛋白質免疫印跡試驗 （Western Blot）利用RIPA 裂解液提取細胞總蛋白，首先收集試驗細胞，加入適量體積的RIPA 裂解液，冰上裂解1 h，期間每隔10～15 min 混勻一次，使細胞裂解充分。4 ℃離心45 min，小心吸出上層蛋白清液，取適量蛋白進行濃度測定，利用Bradford 法測定其濃度。取出適量蛋白用于免疫印跡試驗，其余蛋白分裝好放入-80 ℃冰箱保存。配置體積分數12%的SDS 膠，將Marker、對照組、試驗組蛋白依次進行上樣，設定80 V 電壓開始電泳，當蛋白全部從濃縮膠跑到分離膠時，設定120 V 電壓繼續(xù)蛋白電泳，電泳結束后進行轉膜，350 mA 轉膜1.5 h，隨后根據目的條帶大小剪膜，隨后用5%脫脂奶粉封閉目的條帶1.5 h、孵育一抗過夜。第2 天TBST 溶液清洗3 次，每次15 min，37 ℃恒溫靜置孵育二抗1 h，再經TBST 溶液清洗3 次，孵發(fā)光液顯色，洗片機曝光目的條帶蛋白，掃描儀掃描膠片并保存圖片。

1.3.7 H1299 細胞的轉錄組分析 分別采用藻藍蛋白（試驗組）和PBS 溶液（對照組）處理正常培養(yǎng)的H1299 細胞，48 h 后收集細胞并提取總RNA進行轉錄組測序?；虮磉_量基于FRKM 的方法進行計算，獲得基因表達量FRKM 值。基因的差異比對采用DESeq 軟件進行分析，對DESeq 檢測結果按照差異顯著性標準（差異基因的表達量變化高于2 倍且FDR 值小于0.05）進行篩選，統(tǒng)計基因顯著性差異表達上下調的情況。

1.3.8 數據分析 柱狀圖和折線圖中的試驗數據均以“平均數±標準差”的形式表示，標準差采用Excel 進行方差分析計算得到。顯著性分析采用Excel 進行Student t-test 檢驗計算P 值，其中當P＜0.05 則認定為顯著性差異（*），當P＜0.01 則認定為極顯著差異（**）。

2 結果與分析

2.1 藻藍蛋白促進非小細胞肺癌H1299 細胞凋亡

首先對藻藍蛋白處理后H1299 細胞的凋亡情況進行了驗證。圖1顯示，H1299 細胞經藻藍蛋白作用48 h 后，細胞形態(tài)發(fā)生顯著變化，對照組細胞輪廓清晰，藻藍蛋白處理組細胞尾部伸長成不規(guī)則梭狀，細胞活力降低，肉眼可見有少量漂浮細胞。此外，對細胞凋亡經典蛋白Bax，Bcl-xL 進行了蛋白水平檢測，結果顯示藻藍蛋白處理后引起細胞內促凋亡蛋白Bax 上調，抑凋亡蛋白BclxL 下調。綜上所述，此結果驗證了藻藍蛋白對H1299 細胞的促凋亡誘導作用，為后續(xù)試驗奠定了基礎。

圖1 藻藍蛋白對非小細胞肺癌H1299 細胞凋亡的影響Fig.1 Effect of C-Phycocyanin on apoptosis of NSCLC H1299 cells

2.2 藻藍蛋白處理H1299 細胞后的轉錄組分析結果

為了探究藻藍蛋白在H1299 細胞中的調控機制，本研究對藻藍蛋白處理后的H1299 細胞進行了轉錄組差異基因分析。如圖2所示，轉錄組共篩選出了1 521 個差異基因，其中710 個表達上調的基因 （紅色點表示），811 個表達下調的基因（綠色點表示）。這些差異基因中，TIRAP 是本試驗篩選得到的一個感興趣的基因，在藻藍蛋白處理后出現顯著下調，下調比例約為60%。研究表明，TIRAP 是一個含有TIR 結構域的適配蛋白，可與MyD88 蛋白結合，進而激活、調控NF-κB 并參與對細胞炎癥和細胞凋亡的調控。作為一個細胞活性調控因子，我們推測TIRAP 可能在藻藍蛋白介導的誘導H1299 細胞凋亡過程中參與重要的作用，因此，為了驗證這一假說，本研究對藻藍蛋白的調控機制進行了更深入的研究。

2.3 差異基因TIRAP 的轉錄和蛋白水平驗證

轉錄組結果顯示TIRAP 為藻藍蛋白處理后的一個差異基因，隨后采用定量PCR 和免疫印跡的方法對差異基因TIRAP 進行了生物學驗證。結果如圖3所示，藻藍蛋白處理后，H1299 細胞中TIRAP 的轉錄水平出現了顯著下調，與對照組相比，下調比例約為40%；同時，免疫印跡結果顯示，藻藍蛋白處理后，H1299 細胞中TIRAP 的蛋白表達水平也出現了顯著降低。以上結果表明，藻藍蛋白能夠抑制非小細胞肺癌H1299 細胞中TIRAP的表達，這也進一步對轉錄組的篩選結果進行了驗證。

2.4 siRNA-TIRAP 轉染H1299 細胞對TIRAP表達的影響

為了探究TIRAP 是否與非小細胞肺癌H1299 的凋亡相關，本研究采用RNA 干擾技術，對H1299 細胞進行了siRNA-TIRAP 小片段的轉染試驗，以期干預TIRAP 的表達，圖4顯示了轉染siRNA 后細胞中TIRAP 表達水平的變化結果。由圖中可以看出，H1299 細胞轉染siRNA 后，TIRAP 的轉錄水平出現了極顯著下調，與對照組相比，下降比例達到90%左右；同時，免疫印跡結果也顯示轉染siRNA 后，細胞內TIRAP 的表達量明顯降低。以上結果充分表明，siRNA-TIRAP 小干擾片段在H1299 細胞中作用明顯，顯著干預了TIRAP 的表達，為后續(xù)的試驗奠定了基礎。

2.5 H1299 細胞沉默TIRAP 后對細胞形態(tài)學的影響

圖2 藻藍蛋白處理H1299 細胞后的轉錄組分析Fig.2 Transcriptome analysis of H1299 cells after treatment with C-Phycocyanin

圖3 差異基因TIRAP 的轉錄和蛋白水平驗證Fig.3 Validation of TIRAP expression by qRT-PCR and Western blotting analysis

首先對轉染siRNA 后的H1299 細胞進行了形態(tài)學觀察，結果如圖5所示。由圖可知，H1299細胞沉默TIRAP 后，與對照組相比，細胞形態(tài)出現非正常改變，細胞輪廓不清晰，兩端伸長成不規(guī)則形狀，并且伴隨著大量漂浮的細胞，此結果與藻藍蛋白處理H1299 細胞形態(tài)學變化基本一致（圖1）。由此初步證實TIRAP 參與了藻藍蛋白介導的促進H1299 細胞凋亡的過程。

圖4 siRNA-TIRAP 轉染H1299 細胞對TIRAP表達的影響Fig.4 Effect of siRNA-TIRAP transfection on the expression of TIRAP in H1299 cells

圖5 沉默TIRAP 對H1299 細胞形態(tài)的影響Fig.5 Effects of siRNA-TIRAP transfection on the morphology of H1299 cells

圖6 沉默TIRAP 對H1299 細胞體外增殖能力的影響Fig.6 Effect of siRNA-TIRAP on the in vitro proliferation of H1299 cells

2.6 H1299 細胞沉默TIRAP 后對細胞增殖能力的影響

采用MTT 法對H1299 細胞的體外增殖能力進行了考察。由圖6可知，與對照組相比，轉染siRNA-TIRAP 后，H1299 細胞從第2 天起生長開始受到顯著抑制，在隨后的檢測中，細胞增殖抑制效果更加明顯。此結果表明，干預TIRAP的表達對H1299 細胞的生長具有抑制效果，間接證明了TIRAP 在H1299 細胞凋亡過程中發(fā)揮作用。

2.7 免疫印跡試驗檢測沉默TIRAP 后H1299細胞中凋亡相關蛋白表達

為了進一步驗證沉默TIRAP 能引起H1299細胞的凋亡，本研究對轉染細胞的凋亡相關蛋白進行了檢測。結果如圖7所示，與對照組比較，沉默TIRAP 組細胞中促凋亡蛋白Bax 的表達量顯著上調，而抑凋亡蛋白Bcl-xL 出現顯著下調，以上結果與藻藍蛋白處理H1299 細胞后凋亡蛋白的表達情況基本一致，充分證實了藻藍蛋白能夠通過下調TIRAP 的表達而促進非小細胞肺癌H1299 細胞的凋亡。

2.8 H1299 細胞沉默TIRAP 對NF-κB 信號通路的影響

圖7 H1299 細胞沉默TIRAP 后凋亡相關蛋白的檢測Fig.7 Analysis of apoptosis-related protein expressions in H1299 cells after transfected with siRNA-TIRAP

前期結果證實了藻藍蛋白能夠通過下調TIRAP 表達進而誘導H1299 細胞凋亡，但具體的調控途徑仍不太明確。NF-κB 是一類多功能的核轉錄因子[14-15]，包括控制抗凋亡基因和促凋亡基因表達[16]，研究表明，抑制NF-κB 通路的活化能抑制腫瘤發(fā)展[17]。IKKα 和IKKβ 蛋白被磷酸化后，可以催化通路抑制蛋白IκBα 發(fā)生磷酸化，磷酸化的IκBα 參與蛋白酶體依賴性的降解過程，進而與p65 蛋白發(fā)生解離，p65 蛋白隨后被磷酸化激活，進入細胞核參與轉錄調控作用，激活NF-κB 信號通路[18]。本文對沉默TIRAP 后H1299 細胞的NFκB 信號通路進行了蛋白水平檢測。如圖8為NFκB 通路相關蛋白表達情況，結果顯示，與對照組相比，沉默TIRAP 后，IKKα、IKKβ 以及p65 蛋白的總量變化不大，但它們的磷酸化水平（p-IKKα/β、p-IκBα 和p-p65）都有明顯下調，說明NF-κB通路的活性受到了抑制。以上研究結果表明，藻藍蛋白能夠抑制TIRAP 蛋白的表達，通過降低NFκB 信號通路的活性而誘導H1299 細胞的凋亡。本研究能夠為非小細胞肺癌的治療和藻藍類功能性食用色素的開發(fā)提供新的理論基礎。

圖8 H1299 細胞沉默TIRAP 對NF-κB信號通路的影響Fig.8 Effect of siRNA-TIRAP transfection on the activity of NF-κB pathway in H1299 cells

3 結論與討論

食用色素是食品添加劑的一個重要門類，運用于各類食品行業(yè)中。藻藍色素蛋白作為一種公認的食用藍色素，與目前被人們所熟知的醇溶性靛藍色素相比，顏色更加鮮亮，且具有良好的水溶性，因此有著更加廣泛的應用前景。此外，考慮到化學合成色素的安全性問題，天然食用色素具有“綠色、環(huán)保”等優(yōu)點，迎合了廣大消費者的需求。

藻藍色素蛋白的功能特性是近年來國內外研究的熱點之一，目前已有相關研究報道了藻藍蛋白對肺癌細胞的抑制作用。例如，Madamwar 等[19]證實了藻藍蛋白具有促進肺癌A549 細胞凋亡的能力；Baudelet 等[20]通過研究發(fā)現藻藍蛋白能夠抑制肺癌、黑色素瘤以及乳腺癌細胞的增殖。此外，一些研究者也對藻藍蛋白與其它抗腫瘤物質的聯(lián)合作用進行了研究，例如，Li 等[21-22]發(fā)現藻藍蛋白與全反式維甲酸具有協(xié)同作用，能夠誘導肺癌A549 細胞的凋亡；Bingula 等[23]通過研究發(fā)現藻藍蛋白和甜菜堿的聯(lián)合作用也能夠抑制A549 細胞的增殖能力。本團隊前期的研究結果也表明，除A549 細胞外，藻藍蛋白也對非小細胞肺癌H1299，H460 以及LTEP-a-2 細胞具有促凋亡作用[7]。但是，目前的研究幾乎沒有對藻藍蛋白誘導肺癌細胞凋亡的調控機制進行報道，僅僅從表型層面了解其抗肺癌效應極大地約束了藻藍蛋白的深度應用，搜尋藻藍蛋白的特異性調控靶點能夠為肺癌的靶向治療提供重要的思路。

本研究以H1299 細胞為模型，探究藻藍蛋白誘導其凋亡的作用機制，通過轉錄組篩選出了一個潛在的調控靶點TIRAP。TIRAP 蛋白在細胞中主要是參與MyD88 依賴的信號轉導途徑，當特異性激活TLR2 或TLR4 時，TIRAP 首先移位至細胞膜并通過其氨基端的磷脂酰肌醇二磷酸（phosphatidylinositol 4，5-biphosphate，PIP2）結構域與PIP2 結合，然后再通過保守的TIR（Toll/interleukin 1 receptor domain-containing）結構域與MyD88 蛋白結合并將其募集至TLR 受體，繼而激活下游的轉錄因子NF-κB，誘導細胞炎癥因子表達，從而促進細胞凋亡[24-25]。通過體外轉染小干擾RNA 將TIRAP 沉默，發(fā)現H1299 細胞同樣出現了凋亡情況。本研究發(fā)現藻藍蛋白能夠通過抑制TIRAP 的表達促進肺癌H1299 細胞的凋亡。研究結果能夠為肺癌的潛在治療和抗癌類功能性食品的開發(fā)奠定理論基礎。