乳雙歧桿菌Probio-M8氧氣耐受性馴化研究

王元弛，姚國強，張文羿，張和平

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室農(nóng)業(yè)部奶制品加工重點實驗室 呼和浩特010018）

1899年，Tissier[1]首次在嬰兒糞便中分離到雙歧桿菌。雙歧桿菌對人體保持健康具有重要作用，大量動物和臨床試驗研究表明雙歧桿菌具有促進營養(yǎng)物質(zhì)代謝及吸收，增強宿主免疫能力，改善神經(jīng)焦慮的作用[2-7]。其既可作膳食補充劑，又可作保健食品的功能成分[8-10]。然而，雙歧桿菌氧氣耐受性差，菌體活力會受到較大影響，不利于益生特性發(fā)揮，阻礙了其生產(chǎn)及應(yīng)用。本試驗中采用改變培養(yǎng)基中氧分壓的方法對乳雙歧桿菌Probio-M8 進行氧氣耐受性馴化。通過測定生理特性、氧氣耐受性相關(guān)NADH 氧化酶活性及細胞膜流動性變化，評價氧氣對乳雙歧桿菌Probio-M8 的影響。供試菌株乳雙歧桿菌Probio-M8 （Bifidobacterium animalis subsp.lactis Probio-M8，B.lactis Probio-M8）分離自內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市健康婦女母乳。本試驗對乳雙歧桿菌Probio-M8 氧氣耐受性能力進行研究，為其應(yīng)用及開發(fā)提供思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株乳雙歧桿菌Probio-M8 由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室菌種資源庫提供。

1.1.1 主要試劑 MRS 培養(yǎng)基，英國Oxoid 公司；MRSC 培養(yǎng)基：MRS 培養(yǎng)基添加0.5 g/L 的L-半胱氨酸鹽酸鹽；TPY 培養(yǎng)基，英國Oxoid 公司；脫脂乳培養(yǎng)基[11]：脫脂乳9.5 g，酵母提取物0.5 g，葡萄糖2 g，L-半胱氨酸0.05 g，雙蒸水100 mL；NADH氧化酶活性檢測試劑盒，北京索萊寶科技有限公司。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備 ZHJH-C1112C 無菌工作臺，上海智城分析儀器有限公司；SX-500 全自動高壓滅菌鍋，日本Tomy Digital Biology；LRH-500F 恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；TGL-16B 臺式高速離心機，德國Eppendorf 公司；DG250 厭氧工作站，英國DWS 公司；GRX-9203A全自動干熱滅菌器，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；EF20 pH 計，瑞士梅特勒-托利多公司；Synergy H1 酶標儀，美國BioTek 公司；Research plus 移液器，德國Eppendorf 公司；BX50 光學(xué)顯微鏡，日本OLYMPUS。

1.2 試驗方法

1.2.1 乳雙歧桿菌Probio-M8 的制備和保藏 將保存于凍存管中的乳雙歧桿菌Probio-M8 液體于TPY 固體培養(yǎng)基上劃線；37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)48 h，隨機選取6～8 個單菌落接入10 mL 的TPY 液體培養(yǎng)基試管中；37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)24 h，鏡檢后，挑選1 個符合乳雙歧桿菌Probio-M8 典型菌體形態(tài)的試管，按體積分數(shù)2%接入350 mL 的TPY 液體培養(yǎng)基中；37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)24 h，離心得到菌泥，與脫脂乳培養(yǎng)基混合均勻，吸取500 μL 保存于凍存管中，于-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 生長代數(shù)的計算 將活化后的初始菌株在MRSC 固體培養(yǎng)基平板上進行多次劃線純化后，挑取單菌落于MRSC 液體培養(yǎng)基，置于37 ℃生化培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，30 h 后按2%的接種量進行液體傳代培養(yǎng)1 次，每隔2 h 取樣測定菌株生長過程中活菌數(shù)變化情況，繪制生長曲線。可得到乳雙歧桿菌Probio-M8 到達穩(wěn)定期的時間，并且以該時間作為下一次接種新鮮培養(yǎng)基的時間，以保證菌株穩(wěn)定傳代。將菌株以2%接種量接入新鮮MRSC 液體培養(yǎng)基的活菌數(shù)記為N0，進入穩(wěn)定期時的活菌數(shù)記為Nf，通過公式log2（Nf/N0）計算1個生長周期內(nèi)的生長代數(shù)[12]。

1.2.3 氧氣耐受性馴化 通過控制液體培養(yǎng)基中L-半胱氨酸鹽酸鹽添加，以改變培養(yǎng)基中氧分壓的方法進行氧氣耐受性馴化試驗[13]。首先，挑取純化培養(yǎng)后的單菌落接種到MRSC 液體培養(yǎng)基于厭氧工作站37 ℃下進行培養(yǎng)，采用2%的接種量，連續(xù)傳代馴化培養(yǎng)25 d，每隔10 d 凍菌留樣。再于MRS 液體培養(yǎng)基中連續(xù)馴化培養(yǎng)125 d，每隔10 d 凍菌留樣。不同馴化代數(shù)樣品均于MRS 液體培養(yǎng)基中活化后進行指標測定。

1.2.4 形態(tài)學(xué)觀察 將原始菌株乳雙歧桿菌Probio-M8 與氧氣耐受性馴化后1 000 代菌株進行革蘭氏染色，顯微鏡觀察并照相記錄，對傳代菌株細胞形態(tài)進行觀察[14]。將傳代菌株于MRS 固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，對菌落大小、形態(tài)和顏色進行觀察。

1.2.5 生長情況測定 利用酶標儀測定每傳約70 代馴化菌株處于 （24.00±0.500）h 時培養(yǎng)液的菌體密度（OD600nm）。

1.2.6 產(chǎn)酸能力測定 利用pH 計測定每傳約70代馴化菌株處于（24.00±0.500）h 時培養(yǎng)液的pH值。

1.2.7 氧氣耐受性測定 每傳代約70 代，將氧氣耐受性馴化條件下培養(yǎng)的菌株分別置于有氧及厭氧環(huán)境中37 ℃培養(yǎng)，在（0.00±0.500）h 和（24.00±0.500）h 分別取樣測定其菌體密度，計算RBGR值[15]（有氧環(huán)境下菌體密度/厭氧環(huán)境下菌體密度），以評價其氧氣耐受性。

1.2.8 NADH 氧化酶活性測定 按照試劑盒說明書，每200 代菌株進行NADH 氧化酶活性測定。

1.2.9 細胞膜流動性測定 依據(jù)李寶坤[16]的方法進行脂肪酸含量測定，對比乳雙歧桿菌Probio-M8原始菌株與馴化后菌株細胞膜的脂肪酸含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 18.0 進行單因素方差分析；折線圖、散點圖等使用GraphPad Prism 5.01，Oringin 7.5 繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳雙歧桿菌Probio-M8 生長代數(shù)計算結(jié)果

細菌處于不同生長時期，細胞生理狀態(tài)具有較大的差異，對應(yīng)激環(huán)境的反應(yīng)也不相同。由圖1看出，乳雙歧桿菌Probio-M8 在0～4 h 為延滯期，最初接入活菌數(shù)約為1.26×107CFU/mL；4～16 h 活菌數(shù)迅速增加，為對數(shù)生長期；16 h 后活菌數(shù)趨于穩(wěn)定，進入穩(wěn)定期，活菌數(shù)為1.58×109CFU/mL。參照1.2.2 節(jié)生長代數(shù)的計算方法，到達穩(wěn)定期時菌株的生長代數(shù)約6.97 代。陶天申等[17]研究發(fā)現(xiàn)菌株在對數(shù)生長期后期或者穩(wěn)定期早期是進行菌種傳代和保藏的最佳時期。因此，本研究為了方便試驗的長期操作，選擇（24.00±0.500）h 為一個馴化傳代周期。

圖1 乳雙歧桿菌Probio-M8 原始菌株生長曲線Fig.1 Grow curve of B.lactis Probio-M8 original strain

2.2 乳雙歧桿菌Probio-M8 馴化前、后形態(tài)變化

將乳雙歧桿菌Probio-M8 原始菌株及氧氣耐受性馴化后1 000 代菌株活化培養(yǎng)后進行平板劃線，觀察菌落形態(tài)特征，挑取單菌落進行革蘭氏染色并在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)，對比結(jié)果如表1，圖2，圖3。發(fā)現(xiàn)乳雙歧桿菌Probio-M8 馴化前、后的菌落及菌體形態(tài)均屬于雙歧桿菌典型形態(tài)[18]：氧氣耐受性馴化后菌株與原始菌株相比，菌落形態(tài)較小、菌體變細。

表1 原始及氧氣耐受性馴化后乳雙歧桿菌Probio-M8 形態(tài)特征[18]Table 1 Morphological characteristic of oxygen-tolerance B.lactis Probio-M8 and original strain[18]

圖2 原始及氧氣耐受性馴化后乳雙歧桿菌Probio-M8 菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of oxygen-tolerance B.lactis Probio-M8 and original strain

圖3 原始及氧氣耐受性馴化后乳雙歧桿菌Probio-M8 菌體形態(tài)（×1 000）Fig.3 Morphology of oxygen-tolerance B.lactis Probio-M8 and original strain

2.3 乳雙歧桿菌Probio-M8 馴化過程生長情況變化

測定不同代數(shù)乳雙歧桿菌Probio-M8 在有氧及厭氧環(huán)境中菌體密度（OD600nm）變化，可反映出其在氧氣耐受性馴化過程中生長情況。由圖4可看出，0～270 代之間菌體密度無顯著變化；馴化至340 代時，較0 代菌株相比在有氧環(huán)境下菌體密度增加4.64 倍，厭氧環(huán)境下增加3.86 倍（P＜0.05）；400～1 000 代時，菌體密度無顯著差異；至1 000 代時，有氧環(huán)境下菌體密度為1.11±0.047，厭氧環(huán)境下為1.08±0.047，較0 代菌株相比均有顯著增加，分別增加10.47 倍及7.77 倍（P＜0.05）。王猛等[19]對乳雙歧桿菌BZ11 氧氣耐受性馴化后，發(fā)現(xiàn)馴化后菌株在有氧環(huán)境下菌體密度顯著增加，能更好地適應(yīng)有氧環(huán)境。經(jīng)氧氣耐受性馴化后乳雙歧桿菌Probio-M8 的菌體密度顯著上升，生長情況較好。

2.4 乳雙歧桿菌Probio-M8 馴化過程產(chǎn)酸能力變化

測定不同代數(shù)的乳雙歧桿菌Probio-M8 在有氧及厭氧環(huán)境中pH 值變化，可直觀反映出其在氧氣耐受性馴化過程中產(chǎn)酸能力情況。如圖5所示，0～270 代之間pH 值無顯著變化；馴化至470代時，較0 代菌株相比有氧條件下pH 值顯著降低0.15，厭氧環(huán)境下顯著降低0.14（P＜0.05）；470～1 000 代之間，pH 值無顯著差異；至1 000 代時，有氧環(huán)境下為4.38±0.023，厭氧環(huán)境下為4.36±0.000，較0 代菌株相比pH 值均顯著降低（P＜0.05）。有研究表明，雙歧桿菌氧氣耐受性馴化后，菌株在有氧環(huán)境生長pH 值顯著降低[19-20]。乳雙歧桿菌Probio-M8 在有氧及厭氧環(huán)境中的pH 值隨氧氣耐受性馴化時間延長而呈現(xiàn)遞減趨勢，產(chǎn)酸能力明顯增強。

圖4 氧氣耐受性馴化過程中乳雙歧桿菌Probio-M8 的OD600nm 變化Fig.4 OD600nm of B.lactis Probio-M8 during the oxygen-tolerant domestication in the different conditions

圖5 氧氣耐受性馴化過程中乳雙歧桿菌Probio-M8 的pH 值變化Fig.5 pH change of B.lactis Probio-M8 during the oxygen-tolerant domestication in the different conditions

2.5 乳雙歧桿菌Probio-M8 馴化過程氧氣耐受性變化

1986年，Kikuchi 等[15]提出RBGR 值，一種通過測定有氧條件與厭氧環(huán)境下OD600nm變化比率以評價厭氧菌氧氣耐受性的方法。由圖6可以看出，0～270 代，RBGR 值緩慢增加，無顯著變化；馴化至340 代時，較0 代菌株相比RBGR 值顯著上升0.39（P＜0.05）；至400 代時，較370 代時RBGR 值顯著上升0.11 （P＜0.05）；400～1 000 代時，RBGR值無顯著變化；至1 000 代時，RBGR 值為1.03±0.063，較0 代菌株相比RBGR 值發(fā)生顯著上升0.47（P＜0.05）。Talwalkar 等[21]研究表明氧氣耐受性好的菌株RBGR 值顯著高于其它菌株。綜合上述結(jié)果可推測，乳雙歧桿菌Probio-M8 氧氣耐受性馴化后1 000 代菌株較原始菌株氧氣耐受性明顯增強。

2.6 乳雙歧桿菌Probio-M8 馴化過程NADH 氧化酶活性變化

雙歧桿菌為嚴格厭氧細菌，菌株之間氧氣敏感性存在差異。研究人員對氧氣與雙歧桿菌存活的關(guān)系進行了大量研究，發(fā)現(xiàn)活性氧化物（超氧化物、過氧化氫、羥自由基）的產(chǎn)生造成了雙歧桿菌氧中毒，從而導(dǎo)致細胞死亡[22]。而需氧菌可以通過某些酶（超氧化物歧化酶、過氧化氫酶）分解活性氧化物，是防御氧中毒的主要成分[23]。根據(jù)已有研究，推測厭氧菌可能因為缺乏這2 種酶而造成氧中毒。然而一些研究發(fā)現(xiàn)，NADH 氧化酶活性可能決定了雙歧桿菌對氧氣的耐受能力[24]。乳雙歧桿菌Probio-M8 在馴化過程中NADH 氧化酶活性的變化情況如圖7所示，原始菌株NADH 氧化酶活性處于較低水平，為（53.03±7.57）U；馴化至800代時，NADH 氧化酶活性達到最高，較0 代菌株相比酶活性發(fā)生顯著上升（P＜0.05）。至1 000 代時，為（84.17±1.46）U，較800 代菌株相比酶活性略有下降，無顯著性變化；而較0 代相比菌株酶活性顯著升高（P＜0.05）。Shimamura 等[24]研究了雙歧桿菌氧敏感性背后的酶促機制，發(fā)現(xiàn)NADH 氧化酶水平與菌株氧氣耐受性之間存在相關(guān)性，氧敏感菌株中NADH 氧化酶活性較低。Shin 等[25]研究證實氧氣最敏感雙歧桿菌菌株暴露在有氧環(huán)境中，NADH 氧化酶活性最低；氧氣耐受性最強菌株NADH 氧化酶活性最高。綜合上述結(jié)果可推測，由于乳雙歧桿菌Probio-M8 氧氣耐受性馴化后1 000 代中NADH 氧化酶活性顯著上升，而導(dǎo)致其氧氣耐受性增強。

圖6 氧氣耐受性馴化過程中乳雙歧桿菌Probio-M8 的RBGR 值變化Fig.6 RBGR of B.lactis Probio-M8 during the oxygen-tolerant domestication

圖7 氧氣耐受性馴化過程中乳雙歧桿菌Probio-M8 的NADH 氧化酶活性變化Fig.7 NADH oxidase activity of B.lactis Probio-M8 during oxygen-tolerant domestication

2.7 乳雙歧桿菌Probio-M8 馴化前、后細胞膜流動性變化

細胞膜脂肪酸成分是影響細胞氧氣耐受性的重要指標[26-27]。外界環(huán)境發(fā)生變化，微生物細胞膜首先受到?jīng)_擊，細胞對氧氣的耐受性取決于脂肪酸組成，特別是不飽和程度。在下面的研究中，對氧氣耐受性馴化前后乳雙歧桿菌Probio-M8 細胞膜脂肪酸成分進行了比較分析，結(jié)果見表2，細胞膜脂肪酸成分分別是C12：0（月桂酸）、C14：0（肉豆蔻酸）、C16：0（棕櫚酸）、C16：1（棕櫚油酸）、C18：0（硬脂酸）、C18：1（油酸）、C18：2（亞油酸）、C19cyc11（環(huán)丙烷脂肪酸）。這8 種脂肪酸占總脂肪酸含量的85%以上，說明這8 種脂肪酸是乳雙歧桿菌Probio-M8 主要脂肪酸。經(jīng)過氧氣耐受性馴化后1 000 代菌體中不飽和脂肪酸比例為50.39%，相比原始菌株菌體不飽和脂肪酸含量顯著上升17.26%（P＜0.05），其中C18：1及C18：2比例均顯著上升（P＜0.05）。而飽和脂肪酸含量為49.60%，相比原始菌株68.87%顯著下降（P＜0.05）。其中氧氣耐受性馴化后1 000 代菌體 中C12：0，C14：0，C16：0，C18：0比例較原始菌株菌體有所下降，C18：0顯著下降（P＜0.05）。自然環(huán)境中，細菌面臨諸多不利因素影響時，細胞會啟動自身的臨時適應(yīng)性機制，對細胞進行自我調(diào)控，增強適應(yīng)能力[28]。如增加膜脂質(zhì)中不飽和脂肪酸的比例，維持細胞膜的流動性[16，29]。綜合上述結(jié)果可推測，乳雙歧桿菌Probio-M8 氧氣耐受性馴化后1 000 代菌株不飽和脂肪酸含量顯著上升是其氧氣耐受性增強原因之一。

表2 原始及氧氣耐受性馴化后乳雙歧桿菌Probio-M8 膜脂肪酸相對含量Table 2 Membrane fatty acid composition of oxygentolerance B.lactis Probio-M8 and original strain

3 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，與乳雙歧桿菌Probio-M8原始菌株相比，氧氣耐受性馴化后1 000 代菌株在有氧及厭氧環(huán)境下生長情況良好、產(chǎn)酸能力提升、氧氣耐受性增強、細胞膜流動性提高。即通過改變培養(yǎng)基氧分壓提高乳雙歧桿菌的氧氣耐受性具有一定應(yīng)用潛力，為乳雙歧桿菌Probio-M8 生產(chǎn)及應(yīng)用提供了參考依據(jù)。