食品中丙烯酰胺的形成機理、檢測方法及控制措施研究進展

柴晴晴 武 文 劉鵬飛 李子松 王愛月 崔 波

(1.齊魯工業(yè)大學生物基材料與綠色造紙國家重點實驗室，山東 濟南 250353；2.齊魯工業(yè)大學食品科學與工程學院，山東 濟南 250353；3.解放軍第960醫(yī)院，山東 濟南 250031；4.山東興泉油脂有限公司，山東 臨沂 276600)

丙烯酰胺是淀粉食品高溫加工過程中產(chǎn)生的一種食品污染物，是一種具有神經(jīng)毒性、生殖毒性、免疫毒性和致癌性的有害物質(zhì)[1]。1994年，國際癌癥研究所將其評定為2A類致癌物，即“人類可能致癌物”[2]。如何將食品加工過程中丙烯酰胺含量控制在安全水平也是亟需解決的問題。文章擬結(jié)合近年來國內(nèi)外相關研究，對食品中丙烯酰胺的形成機理、檢測方法和控制措施進行詳細介紹，旨在為切斷或控制食品中丙烯酰胺形成有效措施的提出提供依據(jù)。

1 丙烯酰胺的形成機理

食品中丙烯酰胺的形成是一個復雜的多階段反應過程，目前，公認的理論是“食品熱處理過程中丙烯酰胺的形成與美拉德(Maillard)反應有關，其前體物質(zhì)主要是還原糖與天冬酰胺[3-4]。此外，高油脂食物熱加工過程中也可通過丙烯醛途徑產(chǎn)生少量丙烯酰胺[5]。美拉德反應期間丙烯酰胺的形成也支持這一理論[3-4]。

1.1 天冬酰胺產(chǎn)生途徑

Maillard反應是發(fā)生在羰基化合物與氨基化合物之間的非酶促褐變反應，是食品加工過程中產(chǎn)生風味的重要途徑之一，其反應過程分為3個階段：初期、中期和末期[6]。初期階段主要是還原糖與氨基化合物發(fā)生羰氨縮合及Amadori或Heyns分子重排，而食品中丙烯酰胺的產(chǎn)生主要是在此階段。研究[3-4，7]發(fā)現(xiàn)，將還原糖和天冬酰胺以相同比例混合，并于>100 ℃下加熱一段時間，反應體系中能檢測到大量丙烯酰胺產(chǎn)生，而Zyzak等[8]的同位素(13C和15N)示蹤研究結(jié)果也證明丙烯酰胺分子中的碳原子和氮原子均來源于天冬酰胺。Maillard反應初期，還原糖與天冬酰胺先高溫脫水縮合生成具有高反應活性的Schiff堿，并且可通過以下兩種方式生成丙烯酰胺：① 經(jīng)過Amadori分子重排生成Amadori產(chǎn)物，然后進一步發(fā)生脫水脫氨反應生成二羰基化合物，天冬酰胺和羰基化合物通過Strecker降解機制脫羧并脫氨，進而生成丙烯酰胺[7]。② Schiff堿先經(jīng)過分子內(nèi)環(huán)化反應生成唑烷酮，然后脫羧形成脫羧Amadori產(chǎn)物，而在高溫作用下該產(chǎn)物的C-N鍵斷裂，生成丙烯酰胺[3]。

對于含有大量天冬酰胺的高碳水化合物食品，尤其是馬鈴薯塊莖中的天冬酰胺，甚至可以占到游離氨基酸含量的50%以上，因此高溫加工的馬鈴薯產(chǎn)品中丙烯酰胺含量相對較高[8]。通過降低食品原料中其前體物質(zhì)(還原糖和天冬酰胺)含量可以有效控制丙烯酰胺的形成。

1.2 丙烯醛產(chǎn)生途徑

研究[9]發(fā)現(xiàn)，在高脂肪食品的熱處理過程中，丙烯醛也會產(chǎn)生丙烯酰胺。食品中的甘油三油酸酯在高溫下熱解生成丙烯醛，丙烯醛及其氧化產(chǎn)物丙烯酸均可與氨反應生成丙烯酰胺[9]，因此可通過選擇不同種類的油脂來控制丙烯酰胺的形成[10]。同時，丙烯酰胺也可在室溫下通過丙烯醛途徑形成，故一些低溫加工的食品同樣存在丙烯酰胺的污染問題。

2 丙烯酰胺的檢測方法

熱處理過程中，Maillard反應賦予了食品獨特的風味，同時也是高碳水化合物中丙烯酰胺形成的重要途徑。隨著丙烯酰胺形成機理和毒理學性質(zhì)研究的不斷深入，目前其在食品中檢測方法的研究已成為食品安全檢測領域的研究熱點之一。由于食品系統(tǒng)的復雜性和食品中形成的丙烯酰胺含量低，色譜和質(zhì)譜聯(lián)用技術被廣泛使用并成為檢測丙烯酰胺的成熟方法。但隨著分析技術的發(fā)展和應用，其檢測方法也向多元化方向發(fā)展，如光譜法、生物傳感器法、酶聯(lián)免疫法等。

2.1 色譜法

2.1.1 液相色譜及其聯(lián)用技術 液相色譜法(LC)的樣品前處理不需要進行衍生化，是痕量分析物檢測中應用較普遍的方法，其常用的有紫外(UV)和質(zhì)譜(MS)兩種檢測器。丙烯酰胺是一種不含強生色基團的強極性分子，故在傳統(tǒng)反相吸附劑中保留值低而與其他共萃取成分的分離效果差，且LC-UV檢測的靈敏度和選擇性均不高，所以LC-UV通常僅被用于干淀粉含量制品中較高含量的丙烯酰胺檢測。而鑒于質(zhì)譜檢測器具有靈敏度高和選擇性強的優(yōu)點，LC-MS通常被用于食品體系中低含量丙烯酰胺的檢測[11-13]。中國現(xiàn)行標準中液相色譜—質(zhì)譜/質(zhì)譜法 (LC-MS/MS) 是以13C3標記的丙烯酰胺為內(nèi)標溶液，水溶劑提取凈化處理后用LC-MS/MS測定食品中丙烯酰胺含量[14]。Karasek等[15]以水作溶劑提取樣品中的丙烯酰胺，通過兩步固相萃取去除萃取液中干擾成分，使用高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)對烤栗子和栗子制品中丙烯酰胺含量進行測定，其結(jié)果分別為8～1 278，4～159 μg/kg。Bortolomeazzi等[16]提出了一種利用C18、SCX和SAX 3種吸收劑的混合物制備的固相萃取(SPE)小柱對水提萃取液進行快速純化處理，采用HPLC-MS/MS測定烘焙咖啡中丙烯酰胺含量的方法，結(jié)果顯示丙烯酰胺的回收率為92%～95%，相對標準偏差(RSD，n=6)<5%，檢測限(LOD)和定量限(LOQ)分別為5，16 μg/kg。該方法的樣品前處理簡單快速、靈敏度高、重復性好，能滿足食品中低含量丙烯酰胺檢測的需求，適用檢測范圍廣，但自制固相萃取柱較麻煩，且成本相對較高。Tolgyesi等[17]建立的親水作用色譜法—串聯(lián)質(zhì)譜(HILIC-MS/MS)法以乙腈—水—甲酸(V乙腈∶V水∶V甲酸為69∶30∶1)為萃取劑提取樣品中的丙烯酰胺，離心后取上清液進行稀釋過濾后即可進行定量檢測(咖啡樣品除外)，該法利用高度有機洗脫液增加丙酰胺在液相中保留時間的同時可以排除雜質(zhì)成分的干擾，大大增強了其檢測靈敏度，而d3-丙烯酰胺內(nèi)標物的添加可以消除基質(zhì)效應的影響，結(jié)果顯示丙烯酰胺的回收率為101%～105%，RSD(n=6)<7.6%，LOD和LOQ分別為8，20 μg/kg。與上述其他方法不同，該方法中的提取液無需復雜的純化處理過程，操作簡單，能滿足食品中丙烯酰胺的快速、高效檢測的需求。

2.1.2 氣相色譜及其聯(lián)用技術 與液相色譜不同，氣相色譜法需要對樣品進行衍生化處理以增強丙烯酰胺的穩(wěn)定性和揮發(fā)性，提高檢測靈敏度。GB/T 5009.204—2014采用穩(wěn)定性同位素稀釋技術檢測食品中丙烯酰胺含量，在樣品中加入13C3標記的丙烯酰胺內(nèi)標液，其水提取液利用基質(zhì)固相分散萃取凈化、溴試劑衍生，然后用GC-MS/MS的多反應離子監(jiān)測(MRM)或GC-MS的選擇離子監(jiān)測(SIM)模式進行檢測，該方法的LOQ為10 μg/kg。Luo等[18]建立了一種以二甲基亞砜為提取劑、9-羥基呫噸為衍生劑、同位素標記的d3-丙烯酰胺為內(nèi)標物，采用GC-MS法測定烘焙、煎炸食品中丙烯酰胺含量的方法。結(jié)果表明樣品的加標回收率為90.1%～112.0%，RSD為2.3%～6.1%，LOD為0.7 μg/kg，該方法具有操作簡單、高靈敏度和重復性好等優(yōu)點，可用于各種加工食品中丙烯酰胺含量的測定。

2.2 生物傳感器法

生物傳感器是一種新的微量分析技術。其工作原理是分子識別元件與待測物體特異性結(jié)合并發(fā)生生化反應。產(chǎn)生的生物信息通過信號轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換成定量處理的光、電等信號，并由儀器放大輸出，達到分析檢測的目的[19]。目前常利用血紅蛋白(Hb)和DNA將電化學分析與生物傳感器進行結(jié)合，因其具有操作簡單、選擇性強、靈敏度高、響應迅速、重現(xiàn)性好和基本不受食品體系中其他成分干擾等優(yōu)點，常被用于測定復雜食品體系中的丙烯酰胺含量[20]。如Li等[21]構建了一種修飾的Hb離子液體碳糊電極(Hb/CILPE)的電化學生物傳感器，利用丙烯酰胺與Hb間的相互作用，檢測食品中丙烯酰胺含量，其檢測限可低至5.0×10-12mol/L(S/N=3)。Huang等[22]構建了單鏈DNA修飾金電極(ssDNA/GE)的電化學生物傳感器用于丙烯酰胺測定，其檢測限為8.1 nmol/L，線性范圍為0.4～200.0 μmol/L。

2.3 酶聯(lián)免疫法

酶聯(lián)免疫法是一種利用抗原和抗體之間的高度特異性結(jié)合，通過檢測酶催化底物產(chǎn)生的顯色反應來檢測分析物的方法，具有特異性高、操作簡單、效率高等優(yōu)點，已被廣泛應用于食品檢測領域。作為小分子，丙烯酰胺本身沒有抗原決定簇和免疫原性[23]，不能與相應的單克隆抗體結(jié)合，因此丙烯酰胺經(jīng)常與具有免疫反應的載體蛋白連接形成耦聯(lián)，制備完整的抗原，然后通過免疫反應刺激抗原產(chǎn)生抗體。Preston等[24]利用丙烯酰胺的3-巰基苯甲酸(3-MBA)衍生物作為半抗原與牛甲狀腺球蛋白耦合以制備抗原，并在免疫的大白兔上純化制備多克隆抗體，建立了通過檢測丙烯酰胺的3-MBA衍生物實現(xiàn)對樣品中丙烯酰胺進行定量的免疫分析法。Wu等[25]針對4-巰基苯乙酸(4-MPA)衍生的丙烯酰胺制備了多克隆抗體，制備的抗體對該衍生物具有高度的結(jié)合親和力，而丙烯酰胺易與4-MPA發(fā)生高衍生化反應，基于此建立了丙烯酰胺分析前衍生化競爭性間接酶聯(lián)免疫分析法檢測食品中丙烯酰胺含量的方法。與HPLC-MS/MS相比，該方法具有良好的準確性和可靠性，適用于食品中丙烯酰胺的低成本、快速篩查。

2.4 光譜法

目前丙烯酰胺檢測常用的光譜法有比色法、紫外可見分光光度法和紅外光譜法等。如胡沁沁等[26]利用丙烯酰胺與谷胱甘肽之間的加成反應及金納米顆粒的光學性質(zhì)，建立了比色法用于丙烯酰胺的快速檢測。郝亞楠等[27]利用紫外分光光度法與HPLC法測定同一種樣品中丙烯酰胺含量，其結(jié)果分別為0.705，0.711 mg/kg，證明了紫外分光光度法具有較高的準確度?；诟咛禺愋灾?近紅外信號剖面與監(jiān)控模式識別技術，Wen[28]將便攜式紅外光譜儀用于薯片中丙烯酰胺的快速篩查和含量測定，同時驗證了該方法的可行性，且模型預測的丙烯酰胺含量與采用LC-MS/MS實際測定的丙烯酰胺含量之間具有良好的線性關系，其相關系數(shù)>0.92，預測標準誤差為200～260 μg/kg。

此外，近紅外光譜與視覺反射成像的結(jié)合可用于丙烯酰胺的在線監(jiān)測，實現(xiàn)丙烯酰胺高、低含量樣品的實時分離[29]。與目前常用的色譜法相比，雖然光譜法的靈敏度和精密度相對較低，但該方法具有操作簡便、測量范圍廣和對儀器要求小等優(yōu)點，適合丙烯酰胺的快速檢測，便于在食品企業(yè)中推廣應用。

3 食品中丙烯酰胺的控制方法

3.1 控制原料中丙烯酰胺前體物質(zhì)的量

Yang等[30]研究發(fā)現(xiàn)，薯條中丙烯酰胺生成量與還原糖濃度呈顯著正相關(相關系數(shù)為0.652，P≤0.01)，與天冬酰胺濃度呈正相關(相關系數(shù)為0.432，P≤0.05)，故降低天冬酰胺和還原糖含量可以減少丙烯酰胺的形成。Muttucumaru等[31-32]分析了馬鈴薯品種、貯藏時間和不同加工方式對還原糖、游離天冬酰胺和丙烯酰胺生成量的影響，同時比較了相同加工條件(160 ℃，20 min)下丙烯酰胺生成量和馬鈴薯中天冬酰胺及還原糖濃度的關系，結(jié)果表明不同品種的馬鈴薯中的還原糖和天冬酰胺含量均不同，且天冬酰胺和還原糖含量高的馬鈴薯經(jīng)過高溫加熱處理后生成的丙烯酰胺含量較高。這進一步為通過選擇不同的馬鈴薯，即控制還原糖和天冬酰胺含量來控制丙烯酰胺的生成提供了理論依據(jù)。

3.2 控制食品加工工藝

3.2.1 原料預處理 對原料進行浸泡處理，可以有效降低原料表面和內(nèi)部的還原糖及天冬酰胺含量，從而控制丙烯酰胺的形成。天冬酰胺酶的添加可以分解其前體物質(zhì)天冬酰胺，從而有效降低高溫處理過程中丙烯酰胺生成量[33-35]。Ismial等[36]研究也表明利用鹽溶液、L-半胱氨酸溶液及酸溶液對薯片進行熱浸泡處理，炸薯片中丙烯酰胺的形成量可降低90%以上。Torang等[37]用蒸餾水清洗去除土豆切片表面淀粉后，通過熱水熱燙、天冬酰胺酶(市售天冬酰胺酶和/或產(chǎn)朊假絲酵母天冬酰胺酶)溶液浸泡、熱水熱燙—天冬酰胺酶溶液浸泡、氯化鈉和氯化鈣溶液浸泡、檸檬酸溶液浸泡等方式在油炸前對薯片進行處理，再采用相同的條件進行油炸，分析不同前處理方式對炸薯片中丙烯酰胺生成量的影響，結(jié)果表明天冬酰胺酶浸泡和熱燙處理均能有效降低丙烯酰胺生成量，且兩種酶復合使用或熱燙—天冬酰胺酶浸泡復合處理對丙烯酰胺形成的抑制效果顯著，其中熱燙—市售天冬酰胺酶復合處理可以將丙烯酰胺形成量降低95%。此外，檸檬酸、NaCl和CaCl2溶液浸泡處理也能減少丙烯酰胺的形成，其中檸檬酸的抑制效果最佳，說明降低pH也是減少丙烯酰胺形成的有效途徑[37]。Genovese等[38]研究表明與熱燙處理相比，脈沖電場處理能更有效地抑制丙烯酰胺的形成。

3.2.2 溫度和時間的控制及煎炸用油的選擇 溫度是影響美拉德反應的關鍵因素，也是影響丙烯酰胺形成的重要因素。Martinez等[39]用部分因子設計方法研究了溫度、油炸時間、熱燙處理和馬鈴薯片厚度對薯片中丙烯酰胺含量的影響，并采用化學計量學方法對薯片的加工工藝參數(shù)進行評價，結(jié)果表明溫度和油炸時間對丙烯酰胺含量的貢獻較大。Torang等[37]研究了不同油炸條件對土豆片中丙烯酰胺形成的影響，結(jié)果顯示在150，165，180 ℃下，丙烯酰胺的生成量均因油炸時間的延長而急劇增加，且其形成速率在t=1 min時達到最大，而隨著油炸溫度的升高，丙烯酰胺的生成速率也明顯加快。Bertuzzi等[40]研究發(fā)現(xiàn)，咖啡焙烤過程中焙烤溫度隨時間(0～20 min)的延長而升高，而丙烯酰胺濃度呈先升高后降低的趨勢，并在10 min(175 ℃左右)時達到最高值，進一步說明了在咖啡焙烤過程中存在丙烯酰胺的形成和部分降解，同時也為通過控制加熱時間和溫度來降低食品中丙烯酰胺的含量提供了理論依據(jù)。

Lim等[41]研究了煎炸所用的4種植物油對甜薯薯片中丙烯酰胺含量的影響，結(jié)果表明在不飽和程度較低的油中油炸的甜薯薯片丙烯酰胺含量較低(1 443 μg/kg)，而在不飽和程度較高的油中油炸的甜薯薯片丙烯酰胺含量較高(2 019 μg/kg)。而Zhang等[42]研究發(fā)現(xiàn)，不飽和脂肪酸含量高的煎炸油不會引起丙烯酰胺生成量的增加，丙烯酰胺的形成與煎炸油的傳熱系數(shù)有關，傳熱系數(shù)高的煎炸油會增加丙烯酰胺的形成量。因此，選擇合適的煎炸用油也是控制丙烯酰胺形成的有效途徑。

3.3 添加抑制劑

G?kmen等[43]在果糖—天冬酰胺模型體系中，研究了150，180 ℃下，陽離子對丙烯酰胺形成的影響，結(jié)果表明：二價陽離子幾乎可完全阻止丙烯酰胺的形成，而一價陽離子僅可減少50%丙烯酰胺生成量。這可能與陽離子能阻止丙烯酰胺中間產(chǎn)物Schiff堿的形成有關。A?ar等[44]的研究進一步表明添加陽離子可以有效控制熱加工過程中丙烯酰胺的形成，如添加1.0%乳酸鈣可將曲奇餅干中丙烯酰胺含量從(128±10) μg/kg降至(24±4) μg/kg。

Constantinou等[45]考察了天冬酰胺—糯玉米淀粉美拉德反應模型體系中抗氧化劑(10種酚類物質(zhì))對丙烯酰胺生成的影響，結(jié)果顯示有9種酚類物質(zhì)對丙烯酰胺的形成有抑制作用，且酚類物質(zhì)的結(jié)構和濃度會影響其對丙烯酰胺形成的抑制效果。其作用機理可能是抗氧化劑可以抑制油脂氧化，減少羧基化合物的形成，從而抑制丙烯酰胺的形成。作為一種天然抗氧化劑，花青素對丙烯酰胺的形成具有一定的抑制作用[46-47]，這對于開發(fā)一種安全的新型丙烯酰胺抑制劑，提高熱加工食品的使用安全性，具有十分重要的指導作用。而Qi等[48]的研究進一步發(fā)現(xiàn)，具有不同組成單元或鏈長的原花青素對丙烯酰胺的形成具有相似的抑制活性，其抑制效果很大程度上取決于原花青素的添加量而非其結(jié)構。

此外，在反應原料中加入一定量的蛋白質(zhì)和氨基酸也會降低食品中的丙烯酰胺含量。Kim等[49]研究表明，游離氨基酸可以有效降低薯片中丙烯酰胺含量，其中以賴氨酸、甘氨酸和半胱氨酸的降低效果最顯著，如添加0.5%的甘氨酸可使丙烯酰胺含量減少70%以上。然而，在配方中加入2%鷹嘴豆蛋也會減少油炸薯片中丙烯酰胺含量[50]。這可能是由于游離氨基酸與天冬酰胺競爭以防止丙烯酰胺的形成，而蛋白質(zhì)可以與丙烯酰胺共價結(jié)合以降低其含量。因此，可以在不影響食品品質(zhì)的前提下，添加一定量的抑制劑以降低食品中丙烯酰胺含量。

4 結(jié)論

丙烯酰胺廣泛存在于高碳水化合物的油炸和焙烤產(chǎn)品中，丙烯酰胺引起的食品安全問題受到世界各界的廣泛關注。目前，研究的難點主要是如何在不影響產(chǎn)品質(zhì)量的情況下，切斷或控制食品加工過程中丙烯酰胺的形成。所以，深入研究丙烯酰胺的檢測方法和形成機理，提出降低食品中丙烯酰胺含量、消除食品安全隱患、保護消費者健康的有效措施，將是未來研究的主要內(nèi)容之一。