納豆激酶生理功能及其增產增效與改性研究

馬上超，楊 迪，熊 坤，汪興平*

(1.湖北民族大學 生物科學與技術學院，湖北 恩施 445000； 2.恩施州公共檢驗檢測中心，湖北 恩施 445000)

日本納豆(natto)的食用歷史已有1 000多年，起初是通過家庭手工自然發(fā)酵的方式，將其制成調味品；現在已經形成工業(yè)化純菌種發(fā)酵生產模式.1975年江戶時代在編纂的《江戶本家》(HonchoShokkan)一書中，描述了傳統(tǒng)發(fā)酵大豆-納豆的有益效果.日本的須見洋行博士長期從事天然食品中溶解血栓酵素的研究，1980年在研究尿激酶(UK)及鏈激酶(SK)的溶栓機理時，將納豆置于人工血栓平板上進行孵育，納豆周圍出現了血栓溶解圈[1]；1987年，一種具有強烈的溶解血栓功能的酶從納豆中提取、純化出來，命名為納豆激酶(NattoKinase，NK)[2].血栓是引發(fā)心腦血管疾病及其并發(fā)癥的重要因素，強烈的溶栓功能使納豆激酶備受關注，其功能、機制及相關的高效生產研究迅速展開.1992年，科研工作者已經展開納豆激酶基因序列的研究；2015年納豆激酶作為納豆類保健食品的功效成分已經獲得批準.時至今日，含納豆激酶成分的保健品已經投放市場，但是納豆激酶的研究并未停止，人們仍然在不斷地發(fā)現溶栓以外的生理功能，并通過多種手段提高其產量、有效性、穩(wěn)定性和安全性.本文就近年來的研究成果進行綜述，為納豆激酶的深度開發(fā)奠定基礎.

1 納豆激酶的生物活性功能

1.1 納豆激酶的溶栓功能

據報道，傳統(tǒng)的溶栓藥物，例如阿司匹林[3]、華法林[4]阻止血栓形成的機理主要是發(fā)揮擴張血管、抑制血小板黏附作用，但有引發(fā)心梗、腦梗、腦出血的可能，而且需要長期服用，不能從根本上解決血栓問題.而常用的尿激酶、鏈激酶、纖溶酶原激活劑(t-PA)等可以直接溶解血栓，斬斷纖維蛋白，但是只能在梗塞發(fā)生后，作為搶救藥品，需要限量使用，超量會引發(fā)大出血，且價格昂貴.

納豆激酶提取液在纖維蛋白平板上顯現出溶解效果后，繼而開展有關納豆激酶溶栓活性的研究.李靜等[5]報道納豆激酶活性是尿激酶1.36倍，納豆激酶對血栓的溶解效果較尿激酶更顯著.邵玉英等[6]報道納豆激酶通過延長纖維蛋白凝固時間，抑制凝血酶形成，發(fā)揮抗血小板聚集及抗凝血作用.納豆激酶的溶栓效果顯著，國內已有幾十家公司在生產或銷售納豆類保健產品.

納豆激酶的溶栓途徑多樣，現有作用機理研究表現在以下多方面.納豆激酶可以激活尿激酶原生成尿激酶，間接溶解陳舊血栓，納豆激酶與血管內壁細胞作用，誘導內源纖溶酶原激活劑(t-PA)的產生，同時抑制纖溶酶原激活物抑制劑(PAI)活性，促使t-PA增加[7-9].在人血小板Ca2+動員的體外實驗中，納豆激酶明顯提高血小板環(huán)磷酸腺苷(cAMP)水平，血抑制血小板凝集[10].在動物溶栓實驗中，納豆激酶可以改善血液流變學，抑制血小板聚集，通過促進t-PA和UK基因表達而提高機體的纖溶活性[11].在小鼠的體內實驗中，納豆激酶通過抑制脂多糖(LPS)誘導的血清炎癥因子水平，阻斷了纖維蛋白在經內毒素治療的動物的腎小球中的沉積[12].孟繁宇等[13]報道納豆激酶具有抗炎、抗氧化的效果，并且具有軟化、增加血管彈性，改善血脂及抗動脈硬化作用.

總的來說納豆激酶的溶栓機理可以概括為4個方面：① 纖維蛋白直接溶解活性；② 通過促進尿激酶原生成尿激酶，激活體內纖溶酶原激活劑、抑制纖溶酶原激活物抑制劑，間接促進纖維蛋白溶解；③ 抗血小板凝集作用；④ 抗炎、抗氧化作用緩解血栓的形成.由此可見，納豆激酶從多個路徑層面發(fā)揮溶栓功效，相比于傳統(tǒng)的溶栓藥物，其具有更高的利用價值和更廣闊的發(fā)展前景.

1.2 納豆激酶的抗高血壓功能

根據世界衛(wèi)生組織報道，全球約有11.3億人患有高血壓，高血壓會顯著加劇罹患心臟、大腦、腎臟疾病以及其他疾病的風險.在納豆激酶的功能性研究中，Fujita M等[14]發(fā)現納豆激酶抗高血壓的功效，進一步研究發(fā)現抑制腎素上升、控制血管緊張素轉化酶的生理活性是納豆激酶抗高血壓的主要機理，同時納豆激酶可以減緩血管緊張素Ⅱ濃度升高，有助于血壓平衡.在納豆激酶抗高血壓的動物實驗中，Lee B H等[15]在動物模型實驗中發(fā)現枯草芽孢桿菌發(fā)酵的木豆的水提取物(100 mg/kg)可以改善收縮壓(21 mmHg)和自發(fā)性高血壓大鼠的直立血壓(30 mmHg)；在自發(fā)性高血壓大鼠的降壓作用實驗中，喂食高劑量納豆激酶(2.6 mg/g飲食)的基本飲食組顯示收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)和血漿纖維蛋白原水平顯著降低[16].人體研究表明納豆激酶能降低血壓和平衡血壓.Kim J Y等[17]報道，與對照組相比，攝入含2 000 FU的納豆激酶膠囊，收縮壓(SBP)和舒張壓(DBP)分別減低5.55 mmHg和2.84 mmHg；Gitte J等[18]發(fā)現攝入納豆激酶對于人體收縮壓和舒張壓的平衡具有促進效果，與Fujita M等[14]納豆激酶對于人體血壓平衡的重要作用結果一致.鑒于此，納豆激酶可能在預防和治療高血壓疾病中起重要作用，有望作為膳食補充劑應用到高血壓患者的日常飲食中.

1.3 納豆激酶的抗癌功能

癌癥問題，已經成為世界范圍內的健康問題，研究發(fā)現納豆激酶在抗癌方面展現出一定的功效.Yan Y等[19]研究發(fā)現納豆激酶粗提物(NCE)有效提高HCC荷瘤小鼠的存活率，對患病小鼠的肝腹水有一定的治療效果，顯著降低患病小鼠的腫瘤細胞擴增速度.Huang M等[20]將聚谷氨酸樹狀聚合物通過含二硫鍵的交聯劑與納豆激酶結合，通過體內和體外實驗，顯示了聯合治療結腸癌和血栓類疾病的潛力.Kou Y等[21]通過體內藥代動力學和組織分布分析表明，納豆激酶-聚唾液酸復合物(NK-PSA)可增強模型藥物-阿霉素脂質體(DOX-SAL)的抗腫瘤活性，二者結合可能是清除癌癥先關血栓(CAT)，并提高納米顆粒和免疫細胞到達腫瘤的能力.

1.4 納豆激酶的其他功能

納豆激酶對改善心腦血管疾病、抗高血壓、抗癌等方面表現出較好的作用，隨著研究的深入，納豆激酶的生物活性作用范圍也在逐漸擴大.阿爾茨海默氏病(Alzheimer’s disease，AD)是由細胞線粒體中β-淀粉樣肽的選擇性沉積，影響神經元和關鍵酶功能對葡萄糖的攝取過程，全球約有1800萬AD患者.2013年,就有學者發(fā)現口服納豆激酶在調節(jié)某些表征AD的因素中具有有效作用[22].Prakash B等[23]發(fā)現聚乳酸-乙醇酸(PLGA)包裹的納豆激酶與家族蛋白(ten-eleven translocation-1，TET-1)偶聯的納米顆粒能夠下調淀粉樣蛋白的聚集并表現出纖溶活性，可作為抗AD的有效治療藥物.也有研究人員發(fā)現，納豆激酶相比傳統(tǒng)藥物-辛伐他汀，在預防及治療動脈硬化中具有潛在的臨床應用前景[24].納豆激酶對降低血脂、調節(jié)腸胃、排毒養(yǎng)顏等方面展現潛力，因此，對納豆激酶需進行更深入的研究，合理運用納豆激酶的保健功效，開發(fā)其保健市場.但是目前納豆激酶酶活性半衰期短，口服攝取時生物利用率低，而直接注射使用又容易引發(fā)出血，這些特性仍需改善.

2 納豆激酶增產技術研究

2.1 納豆激酶生產優(yōu)化

納豆激酶主要以野生型枯草芽孢桿菌或基因工程菌接種到固體原料或液態(tài)材料中發(fā)酵產生，使用豆類或者配比合適的營養(yǎng)液作為發(fā)酵基質可以高效的生產納豆激酶.豆類原料用于大規(guī)模工業(yè)化生產納豆激酶成本較高，將工業(yè)生產的副產物廢料與納豆激酶的生產結合，解決工業(yè)資源浪費，提高資源利用率，降低了納豆激酶的生產門檻.豆渣和豆粕中富含蛋白質、膳食纖維、礦物質和維生素等[25]，適宜于納豆激酶的生產.張紅運等[26]和古亞楠[27]將發(fā)酵的營養(yǎng)基質由培養(yǎng)基改為豆渣和豆粕，并將傳統(tǒng)固體發(fā)酵改良為液體發(fā)酵，降低原料成本，提高生產效率.Ju S等[28]通過正交試驗確定了枯草芽孢桿菌亞種WTC016生產納豆激酶的最佳發(fā)酵條件.芝士乳清是乳品發(fā)酵工業(yè)中營養(yǎng)豐富的工業(yè)廢料，Sahoo A等[29]將其作為一種低成本的發(fā)酵培養(yǎng)基用于枯草芽孢桿菌的生長和納豆激酶的生產.Lan G等[30]選擇將納豆發(fā)酵菌與乳酸菌和雙歧桿菌混合發(fā)酵，與單菌株發(fā)酵相比，納豆激酶產量得到提升.Amin K等[31]在納豆激酶生產研究中發(fā)現，調節(jié)發(fā)酵液的亞硒酸鈉濃度至5 mg/L，納豆芽孢桿菌的發(fā)酵活力顯著提高；大豆分離蛋白酶解物作為芽孢桿菌的補充氮源，對納豆激酶的酶活力也具有促進作用[32].

2.2 納豆激酶生產菌轉基因改造

1992年，Nakamura T等[33]對納豆激酶進行基因測序，為納豆激酶活性利用和產酶能力的提高打下基礎.納豆激酶的生產菌株由天然菌株發(fā)展為轉基因菌株，常用的有大腸桿菌、釀酒酵母、地衣芽孢桿菌、假單孢銅綠菌等.Mohammadi F等[34]和王開敏等[35]通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增基因片段，構建納豆激酶重組質粒，誘導表達到大腸桿菌BL21(DE3)、釀酒酵母H158，獲得了具有纖溶活性的納豆激酶.Cai D等[36-38]通過誘導基因突變的方式，將地衣芽孢桿菌、銅綠假單胞菌作為基因工程菌株，顯著提高納豆激酶的生產效率.Liu Z等[39]構建了枯草芽孢桿菌WB800菌株6個具有單一啟動子不同的質粒重組菌株(PP43、PHpaII、PBcaprE、PgsiB、PyxiE或PluxS)，設置隨機串聯質粒組別，最終PHpaII-PHpaII-PP43排列情況下納豆激酶在啟動子介導下的最高產率達到264.2±7.0 FU/mL，納豆激酶產率顯著提高.Cai Y等[40]通過DNA家族包裝技術將3個同源基因改組以產生突變體文庫，應用于納豆芽孢桿菌，所產的納豆激酶活性是野生型的2.3倍.對發(fā)酵菌種基因改造顯著提高發(fā)酵過程中納豆激酶的產率，推進了納豆激酶的產業(yè)發(fā)展.

3 納豆激酶的增效措施及其穩(wěn)定性與安全性

3.1 納豆激酶增效性研究

有人發(fā)現，從紅辣椒中分離出的亞油酸促進了納豆激酶介導的纖維蛋白原的降解[41]，因此，以納豆激酶和不飽和脂肪酸油的組合攝入，可能是治療心血管疾病的新途徑.Ren L等[42]通過偶聯劑的作用，將納豆激酶固定于磁性納米粒子其最佳溶栓活性比純納豆激酶提高9.03%.黃夢杰[43]將靶向分子精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)通過羧氨反應連接到樹狀大分子上，隨后通過化學方法將多谷氨酸樹狀大分子顆粒結合到納豆激酶的周圍，獲得了具有血栓靶向性和較高酶活性的納豆激酶.

納豆激酶的靶向性研究，減少了藥物的必需攝入劑量，有望實現將藥物效用最大化.Kou Y等[21]通過靜電作用將聚唾液酸(PSA)與納豆激酶形成復合物(NK-PSA)并用阿霉素脂質體用作模型藥物，結果表明納豆激酶聚合物可以提高納米顆粒和免疫細胞的遞送能力.鄧柳艷和張建華[44]將微膠囊技術應用于納豆激酶的靶向性研究，用葉酸靶向納豆激酶，微膠囊處理后，在體外模擬胃環(huán)境實驗納豆激酶的活性保留率達60%；有研究者將納豆激酶通過擴散加載到微膠囊中，其漸進的釋放過程有較高的靶向活化血小板活性[45].Wu C等[46]將納豆激酶與聚賴氨酸樹脂狀大分子(PLLD)通過納米技術制備成一種小分子復合材料，有效控制了納豆激酶釋放功效的作用位點，為納豆激酶的安全性提供新的研究方向.

3.2 納豆激酶的穩(wěn)定性

納豆激酶較易受不良環(huán)境影響而喪失生物活性，酶的穩(wěn)定性主要與其分子結構特征和表面活性基團有關，Liu Z等[47]通過表面電荷工程序列對比，并基于文獻構建了11個突變體，并針對其獨特的催化特性篩選了4個單點突變：Q59E增加了比活性、S78T提高了酸穩(wěn)定性、Y217K增強了耐酸性和熱穩(wěn)定性、N218D改善了熱穩(wěn)定性，進而構建并表征了多點位突變體，獲得了具有更好的酸穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性的一種突變體菌株.蒙新睿[1]和趙菡[48]在納豆激酶的熱穩(wěn)定性提高研究中，將相關點位的氨基酸進行篩選突變，其穩(wěn)定性提高效果明顯.

3.3 納豆激酶的安全性

納豆激酶作為一種注射制劑用于血栓疾病時，易被識別為免疫抗原，而引發(fā)出血.Vianney Y M等[49]通過預測納豆激酶的B細胞表位，準確找到氨基酸殘基中負責免疫原性的位點，進行包埋改造，在保持納豆激酶生物活性的同時，提高其作為可注射治療蛋白質的安全性.溫度過高的情況下，納豆激酶溶栓活性常被認為已經喪失，但是有文章報道經高溫處理后，納豆激酶激活t-PA酶原的活性功能仍然存在，而這種特性對常規(guī)血栓藥物敏感患者有更溫和的效果[50]，對于納豆激酶的安全應用具有一定的指導作用.當納豆激酶的使用量達到300 mg/kg時，會引發(fā)肺出血，納豆激酶的標準安全邊際(SSMs)為4.0，Guo H等[51]將地塞米松與納豆激酶聯合治療血栓類疾病，其SSMs擴大至8.0.牛磺去氧膽酸鹽(TUDCA)具有維持細胞穩(wěn)態(tài)的作用，其機制與其調節(jié)細胞膜的磷脂和蛋白質功能有關，Feng R等[52]制備了一種新型納豆激酶-?；侨パ跄懰?NK-TUDCA)復合物，顯著降低納豆激酶的出血概率.因此，將具有緩釋和穩(wěn)態(tài)功能的大分子與納豆激酶聚合，抑制納豆激酶強烈溶栓效果，可以為納豆激酶的溫和釋放溶栓功能創(chuàng)造條件.

4 結語

納豆激酶抗血栓的功效研究已經非常明確，作為保健食品已經面向市場.但是其溶栓以外的生理功效研究還不夠深入，機理尚不明確，應該繼續(xù)加大研究力度，以拓展納豆激酶的應用范圍，這將極大的提升其發(fā)展前景.

納豆激酶作為保健食品投放市場，其熱穩(wěn)定性差將極大地限制與其他食品的復配并嚴重影響其功效，因此正確的趨利避害，了解納豆激酶的分子結構和化學性質，并且根據其特性，有針對性的設計納豆激酶的改性產品，以提高其穩(wěn)定性、安全性和利用率，是今后仍將努力的方向.